Методическая статья

Анализ и визуализация остеоцитов

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64699

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании описан метод визуализации и разработки трехмерных (3D) моделей остеоцитов в лакунарно-каналикулярной сети (LCN) для анализа вычислительной гидродинамики (CFD). Модели, созданные с помощью этого метода, помогают понять механоощущения остеоцитов в здоровых или больных костях.

Аннотация

Остеоциты — это костные клетки, которые, как считается, реагируют на механические деформации и напряжение сдвига потока жидкости (FFSS), активируя различные биологические пути в процессе, известном как механотрансдукция. Модели сетей остеоцитов, полученные на основе конфокальных изображений, являются ценным инструментом для проведения анализа вычислительной гидродинамики (CFD) для оценки сдвиговых напряжений на мембране остеоцитов, которые не могут быть определены путем прямого измерения. Вычислительное моделирование с использованием этих изображений микроструктурной архитектуры кости с высоким разрешением было использовано для численного моделирования механической нагрузки, оказываемой на кость, и понимания индуцированной нагрузкой стимуляции остеоцитов.

В этом исследовании подробно рассматриваются методы разработки 3D-моделей одиночных остеоцитов с использованием конфокальных микроскопических изображений лакунарно-каналикулярной сети (LCN) для выполнения CFD-анализа с использованием различных программ вычислительного моделирования. Перед конфокальной микроскопией кости мыши разрезают и окрашивают красителем флуоресцеина изотиоцианата (FITC) для маркировки LCN. При 100-кратном разрешении изображения Z-стека собираются с помощью конфокального микроскопа и импортируются в программное обеспечение MIMICS (программное обеспечение для обработки 3D-изображений) для построения поверхностной модели LCN и остеоцитарно-дендритных процессов.

Затем эти поверхности вычитаются с помощью булевой операции в программном обеспечении 3-Matic (программное обеспечение для оптимизации 3D-данных) для моделирования лакунарного жидкостного пространства вокруг тела клетки остеоцита и каналикулярного пространства вокруг дендритов, содержащих лакуноканаликулярную жидкость. 3D объемная геометрия жидкости импортируется в программное обеспечение ANSYS (программное обеспечение для моделирования) для анализа вычислительной гидродинамики. Программное обеспечение ANSYS CFX (CFD) используется для приложения физиологической нагрузки на кость в виде давления жидкости, а также для определения напряжений сдвига стенок на остеоциты и дендритные процессы. Морфология LCN влияет на значения напряжения сдвига, воспринимаемые клеточной мембраной остеоцитов и клеточными процессами. Таким образом, детали того, как разрабатываются модели на основе конфокальных изображений, могут быть ценными для понимания механоощущения остеоцитов и могут заложить основу для будущих исследований в этой области.

Введение

Предполагается, что остеоциты регулируют костную массу в ответ на физические упражнения1. Мембранная деформация остеоцитов и их дендритные процессы, обусловленные механической нагрузкой, подвергают их FFSS, который обнаруживается остеоцитами и запускает внутриклеточную сигнализацию 2,3,4. Микроструктура кости претерпевает ухудшение или изменения в ее лакунарно-каналикулярной морфологии из-за старения или заболеваний костей, таких как остеопороз и диабет, а также при таких состояниях, как дефицит перлекана, который вызывает нарушение механочувствительности остеоцитов 5,6. Эти изменения в архитектуре костей заставляют остеоциты испытывать различные уровни FFSS и штаммы 7,8. Важно отметить, что FFSS, испытываемые остеоцитами в ответ на механическую нагрузку, трудно количественно оценить in vivo, поскольку они встроены в кальцинированный костный матрикс.

Моделирование на основе конфокальных изображений является мощным методом преодоления ограничений изучения недоступных остеоцитов в их естественной среде путем воспроизведения компьютерных моделей LCN 9,10. Обработка и моделирование взаимосвязанной сети LCN в 3D была сложной задачей. Существует несколько методов визуализации, таких как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), последовательное блочное сечение лица и последовательная сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (FIB/SEM)2,11,12. Была разработана ценная методика для визуализации костей 13,14,15 и создания 3D-моделей остеоцитов с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). CLSM был выбран здесь для вычислительного моделирования, а не для других методов визуализации, из-за его способности отображать весь объем лакуны и большую часть каналов в 3D16,17. Геометрия LCN может быть сгенерирована с помощью CLSM для анализа остеоцитов методом конечных элементов (FEA) для прогнозирования деформаций костей. Однако анализ жидкости для прогнозирования FFSS, испытываемой остеоцитами, является более сложным, поскольку он требует моделирования клеточной мембраны остеоцита и его дендритов в пределах LCN, чтобы можно было моделировать узкое лакунарно-каналикулярное пространство, в котором интерстициальная жидкость движется вокруг18.

В этом протоколе краситель флуоресцеин изотиоцианат (FITC) наносится на недекальцинированные толстые срезы кости перед конфокальной микроскопией для маркировки LCN внутри кости, а остеоцитарно-дендритные мембраны моделируются на основе данных визуализации LCN. Лакунарно-каналикулярное пространство моделируется с помощью компьютерного моделирования, а физиологическая нагрузка из-за физической активности моделируется с помощью CFD-подхода. Остеоциты подвергаются воздействию градиента давления жидкости в программном обеспечении CFD для анализа профиля жидкости внутри LCN и измерения FFSS на остеоцитарной и дендритной мембранах. Кроме того, подход МКЭ может измерять деформации или напряжения остеоцитов путем применения сжимающего механического нагружения.

Также был разработан метод модификации геометрии для модификации микроструктур, полученных на основе изображений молодых, здоровых костей, с целью моделирования измененной лакунарно-каналикулярной морфологии у пожилых животных или животных с заболеваниями костей. Изменения микроструктуры кости включали уменьшение количества каналиков с возрастом, уменьшение площади лакунарно-каналикулярного пространства для моделирования того, что происходит при дефиците перлекана, и его увеличение для моделирования эффектов старения, а также уменьшение площади каналикулярной и дендритной стенки для моделирования диабетической кости 5,6. Метод модификации геометрии позволяет нам сравнивать FFSS, испытываемые остеоцитами в костях с различными микроструктурами, такими как молодые и старые или кости здоровых и больных животных.

В целом, моделирование на основе конфокального изображения является ценным инструментом для моделирования морфологии остеоцитов в здоровых костях, а также для стареющих/связанных с заболеваниями изменений в морфологии остеоцитов. Кроме того, морфологические параметры остеоцитов, такие как площадь поверхности и объем лакунарно-каналикулярного пространства, могут быть измерены и сравнены в различных костях для прогнозирования клеточных реакций на механическую нагрузку.

Протокол

Эксперименты на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Миссури, Канзас-Сити (UMKC), и соответствовали соответствующим федеральным рекомендациям.

1. Процесс подготовки кости

  1. Соберите бедренные кости у 4-месячных и 22-месячных самок мышей C57BL6 и зафиксируйте их в холодном 4% параформальдегиде в PBS на 24 ч при 4 °C с легким покачиванием, затем промойте их в PBS и храните в 70% этаноле перед закладкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксирующий объем должен быть примерно в 20 раз больше объема ткани
  2. Быстро встраивайте кости в быстро полимеризующийся акрил (Таблица материалов), следуя инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа важно использовать быструю полимеризующуюся смолу (~10 минут). Цель состоит в том, чтобы поддержать костную ткань во время разрезания с помощью алмазной пилы, но без проникновения смолы в LCN, которая блокировала бы проникновение пятна FETC.
  3. Вырежьте толстые поперечные ломтики толщиной 300 мкм на стандартизированном участке над третьим вертелом с помощью алмазной пилы и храните их при температуре 4 °C в 70% этаноле перед окрашиванием FITC.
  4. Шлифуйте срезы с помощью наждачной бумаги с зернистостью 600, 800, а затем 1200 до конечной толщины ~90-100 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение нужной толщины было обеспечено с помощью цифрового штангенциркуля.
  5. Промойте секции в 70%, 95% и 100% этаноле в течение 5 минут каждая.
  6. Окрасьте их в 1% FITC в 100% этанол в течение 4 ч при комнатной температуре (RT) в темноте с умеренным встряхиванием.
  7. Промыть секции в 100% этаноле в течение 30 минут с легким встряхиванием в темноте. Затем высушите их на воздухе в течение ночи в темноте.
  8. Для монтажа поместите секцию в каплю монтажного материала на предметном стекле для микроскопа. Используйте щипцы, чтобы расположить срез как можно ровнее относительно предметного стекла, избегая образования пузырьков воздуха и используя окружающую смолу для манипуляций с образцом. Закрепите на образце покровное стекло.

2. Конфокальная микроскопия

  1. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации окрашенных FITC костных срезов.
  2. Используйте масляный объектив 100x 1,44NA с цифровым зумом 1,7 и шагом 0,126 мкм для сбора детализированных Z-стеков из 400 Z-плоскостей с разрешением 1024 x 1024 пикселей и разрешением 0,089 мкм.
  3. Для возбуждения используйте лазер с длиной волны 488 нм, с окном сбора излучения 496-596 нм. Собирайте стеки изображений с помощью настроек компенсации для коррекции потери сигнала с увеличением глубины изображения.
  4. Повысьте точность и разрешение изображений с помощью таких методов сбора изображений, как избыточная дискретизация и увеличенное усреднение линий. Кроме того, соберите изображения поперечных срезов бедренных срезов бедренных срезов с увеличением в 5x, 20x и 100x, как показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение с низким разрешением (5x) на рисунке 1 показывает полную площадь поперечного сечения бедренной кости с тремя областями, выбранными для 100-кратных полей изображения.
  5. Используйте 100x Z-стеки для компьютерного моделирования остеоцитов.

3. Компьютерное моделирование

  1. Импортируйте собранные 100-кратные изображения в формате TIFF в программное обеспечение ImageJ для построения последовательности изображений LCN в направлении Z.
  2. Импортируйте Z-стеки в программное обеспечение для обработки 3D-изображений для создания маски LCN после определения ориентации изображения.
  3. Пороговое значение исходного изображения от молодых и старых мышей от 30 012 до 45 677 единиц Hounsfield и 15 000-46 701 единиц Hounsfield соответственно, чтобы оно было очень похоже на LCN. Настройте Порог в меню раздела, чтобы изменить пределы интенсивности пикселей для включения в маску.
  4. Обрежьте одну лакуну с ее каналикулами в качестве области интереса (ROI) из стека с помощью операции Crop Mask . Определите ROI таким образом, чтобы он окружал лакуну в центре куба, а все соединенные с ним каналы простирались до сторон куба. Заключите лакуну в воображаемый куб большего размера со сторонами 21 мкм, 14 мкм и 19 мкм.
  5. Поскольку модель создается из нескольких частей, выполните операцию увеличения области, чтобы выбрать соединенные области пикселей, удалить шум и удалить пятна для создания однородного LCN.
  6. Преобразуйте лакунарно-каналикулярную маску в объект с помощью операции «Вычисляемая деталь » в программном обеспечении для обработки 3D-изображений.
  7. Постройте остеоцитарную и дендритную мембраны, уменьшив объем LCN с помощью операции Smoothing. Выполняйте эту операцию несколько раз для достижения толщины лакунарного и каналикулярного пространства 0,75 мкм и 0,08 мкм соответственно 9,18.
  8. Экспортируйте объекты (формат STL) в качестве последнего шага в программном обеспечении для обработки 3D-изображений.
  9. Импортируйте два слоя LCN и остеоцитарно-дендритных мембран в программное обеспечение для оптимизации 3D-данных для создания объемной сетки.
  10. Используйте инструмент «Мастер исправления » в программном обеспечении для выявления проблем сетки в каждой детали. Проверяйте качество сетки в разделе диагностики Fix Wizard после каждой операции.
  11. Удалите инвертированные нормальные детали, пересекающиеся треугольники и плохие контуры с помощью операции «Автоисправление » в мастере исправления.
  12. Замените перекрывающиеся треугольники вручную, определив новые, или автоматически с помощью операции Заполнить отверстие нормально .
  13. Улучшите качество сетки с помощью таких операций, как фильтрация острых треугольников, маленьких ребер и небольших оболочек.
  14. После улучшения качества сетки объедините две поверхности LCN и остеоцитарно-дендритной мембран в одну поверхность (лакунарно-каналикулярное флюидное пространство), которая принадлежит обеим частям, используя немногообразную сборку.
  15. Создайте объемную модель лакунарно-каналикулярного пространства с помощью операции Remesh , а затем экспортируйте ее в виде файла STL. Настройте масштаб объекта в микрометрах в разделе экспорта.

4. Методика модификации геометрии в программах обработки 3D-изображений и оптимизации 3D-данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод модификации геометрии используется для моделирования изменений морфологии остеоцитов, таких как плотность и диаметр каналов и толщина лакунарно-каналикулярных каналов в результате старения или заболевания костей.

  1. Выберите молодой остеоцит в качестве базовой модели и модифицируйте его для построения других различных моделей остеоцитов, применяя морфологические изменения.
  2. Создайте модель остеоцитов с различной плотностью каналов по сравнению с базовой моделью, изменив пороговое значение изображения в программном обеспечении для обработки 3D-изображений.
    1. Выберите более низкий порог, чтобы уменьшить интенсивность света изображения и получить лакуну с меньшим количеством каналов. Преимущество метода порогового определения заключается в том, что форма и размер лакуны остаются прежними, и изучается только влияние плотности каналикулов. На рисунке 2 показана смоделированная старческая модель, созданная из молодого остеоцита с использованием метода модификации геометрии.
  3. Разрабатывайте модели остеоцитов с различной толщиной лакунарно-каналикулярного пространства или диаметрами дендритов/каналикулов в программном обеспечении для обработки 3D-изображений и оптимизации 3D-данных. Создавайте большие или меньшие модели остеоцитов с помощью операций обертывания или сглаживания соответственно. На рисунке 3 показаны шесть моделей остеоцитов с измененной геометрией, разработанных из молодого остеоцита.

5. Анализ CFD

ПРИМЕЧАНИЕ: После создания объемных моделей остеоцитов в модуле CFX программного обеспечения для моделирования выполняется несколько этапов, включая геометрию, сетку и настройку.

  1. Создайте поток жидкости в программном обеспечении для моделирования, чтобы подготовить модели к анализу вычислительной гидродинамики.
  2. Импортируйте разработанные геометрии на основе конфокальных изображений в раздел геометрии CFX, известный как ANSYS SpaceClaim (инструмент 3D-моделирования). Установите размеры единиц измерения в нанометрах в настройках.
  3. Геометрия предстает как две грани LCN и остеоцитарно-дендритных процессов. Нажмите « Фасет » в верхнем меню и удалите геометрические ошибки, такие как пересечения, острые или пересоединенные ребра, а также вершины, отверстия или отверстия для каждой грани.
  4. Нажмите кнопку «Вычесть » в меню «Фасетка », чтобы уменьшить меньшие фасетки и остеоцитарно-дендритные процессы из более крупной фасетки, LCN, чтобы получить единое тело лакунарно-каналикулярного пространства. Затем щелкните правой кнопкой мыши по сгенерированному фасету и преобразуйте его из фасетов в сплошную область без объединения граней. На рисунке 4 изображена площадь поперечного сечения модели молодого остеоцита, которая представляет собой лакунарно-каналикулярное пространство.
  5. Нажмите на сетку и выберите линейные тетраэдрические элементы, используя размер элемента 0,06 мкм. Уточните сетку с помощью исследования сходимости сетки, чтобы в крошечной дендритной системе было достаточно элементов, чтобы гарантировать, что результаты не зависят от размера сетки.
  6. Выберите поверхность и выберите канальцы на верхней стороне воображаемого куба в качестве входных отверстий для жидкости. Выберите каналы на остальных пяти гранях в качестве выпусков жидкости с помощью функции Box select.
  7. Экспортируйте меш (в беглом формате файла), так как он быстрее загружается в настройках на следующем шаге.
  8. Создайте еще один поток жидкости в программном обеспечении для моделирования и импортируйте текучую сетку в раздел настройки CFX. Задайте два граничных условия входов и выпусков для граней, предварительно выбранных в качестве входов/выпусков, с помощью параметра "Вставить границу ".
  9. Чтобы имитировать физиологические условия, приложите давление на входе и выходе жидкости 300 Па и 0 Па соответственно19,20. Остальные поверхности обработайте как стены с условием отсутствия скольжения в той жидкости, которая имеет нулевую скорость на границе стенок. Жидкость вытекает из входных отверстий вокруг дендритов и тела клеток остеоцитов и выходит из других каналов, назначенных в качестве выходов.
  10. Обрабатывайте интерстициальную ламинарную жидкость как воду9, выбранную из библиотеки материалов. Задайте для разделов "Теплопередача", "Горение" и "Тепловое излучение " значение " Нет", так как в задаче теплопередача не определена. Выберите режим Turbulence (Турбулентность ) в качестве характеристики жидкости в LCN, которая является ламинарной жидкостью9.
  11. Запустите программное обеспечение, используя Double Precision и Direct Start в качестве типа отправки. Следите за массой и импульсом до тех пор, пока остатки не упадут и не станут постоянными. После сходимости решений измерьте данные FFSS с помощью раздела CFD-post программного обеспечения для вычислительной гидродинамики.

6. Постобработка CFD

  1. Чтобы изобразить FFSS, испытываемую остеоцитами и их дендритами, вставьте новый контур в раздел результатов программного обеспечения CFD. Создайте контур FFSS, выбрав сдвиг стенки на остеоцитарно-дендритных мембранах в качестве переменной в домене.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы лучше отображать высокий FFSS на дендритных мембранах, диапазон FFSS устанавливается в значение User Specified для изменения минимальных/максимальных значений FFSS.
  2. Вставить контур скоростных течений внутрь лакунарно-каналикулярной области, начиная от входов. Установите равномерное расстояние между выборками и выберите количество точек как 2500. Раздел анимации в программном обеспечении вычислительной гидродинамики точно отображает в 3D, как частицы жидкости протекают внутри лакунарно-каналикулярных пространств с помощью графика линии потока скорости.
  3. Используйте инструмент «Калькулятор функций » в программном обеспечении для вычислительной гидродинамики для анализа величины FFSS или скорости на основе геометрических параметров, особенно при наличии различных моделей остеоцитов (т. е. молодые и пожилые). Измерьте объем и площадь поверхности лакунарно-каналикулярного пространства в виде геометрических параметров вместе с максимальными, минимальными или средними значениями FFSS.

Результаты

В этом протоколе описывается, как разрабатывать конфокальные модели остеоцитов для исследования величины напряжения сдвига потока жидкости, которому подвергается остеоцит и его дендритные процессы из-за механической нагрузки. Старая и молодая мышь C57BL6 были выбраны для создания молодых и старых моделей остеоцитов на основе конфокального изображения. Шесть других симулированных моделей остеоцитов были созданы на основе той же модели молодых остеоцитов с использованием метода модификации геометрии для изучения изменения морфологии LCN из-за старения или заболевания костей. Параметры, модифицированные геометрией, включали лакунарно-канальную толщину, плотность каналикуляра и диаметр. Модифицированные модели остеоцитов были разработаны путем изменения одного параметра за раз при сохранении других параметров на прежнем уровне. Таким образом, влияние каждого из морфологических параметров на FFSS рассматривается изолированно. Результаты показали, что количество FFSS, испытываемое остеоцитами, было различным в этих моделях остеоцитов, что свидетельствует о зависимости FFSS от морфологии LCN. Значения FFSS были предсказаны на различных частях модели остеоцитов, таких как тело клетки остеоцита или дендритные мембраны. Дендриты во всех моделях имели более высокие значения FFSS, чем мембрана тела клетки остеоцита.

На рисунке 5 показаны контуры FFSS для молодых и старых моделей остеоцитов, сгенерированных непосредственно из конфокальных стеков изображений FITC и шести других моделей остеоцитов, разработанных на основе модели 1 с использованием метода модификации геометрии. Средний FFSS на остеоцитарных и дендритных мембранах в модели молодого остеоцита (модель 1) составил 0,42 Па, что более значимо, чем средний FFSS в 0,13 Па в модели старого остеоцита (модель 2). Полученные данные свидетельствуют об увеличении среднего значения FFSS в остеоцитах с большим лакунарно-каналикулярным пространством (Model 7 и Model 8) и снижении FFSS в остеоцитах с более низкой каналикулярной плотностью (Model 3 и Model 4), в то время как в Model 5 и Model 6 FFSS достоверно не изменялся при изменении диаметра дендритов. Модель 2 и модель 4 имели самые низкие значения FFSS — 0,19 Па и 0,13 Па соответственно. Величина FFSS в модели 8 выше, чем в других моделях остеоцитов. Мало того, что большинство дендритов окрашены в красный цвет в модели 8, но и тело остеоцитарной клетки также имеет более высокий FFSS, чем в других моделях.

FFSS, испытываемые остеоцитами, также были представлены на основе объема лакунарно-каналикулярного пространства и площади поверхности, которые были получены путем постобработки в ANSYS CFX для выяснения корреляции между FFSS и измененной структурой LCN. Также удалось измерить площадь поверхности каждой модели, подвергшейся воздействию FFSS более 0,8 Па, что, как считается, является уровнем FFSS, вызывающим образование кости21,22. Моделирование остеоцитов показало корреляцию между средним значением FFSS и объемом лакунарно-каналикулярного пространства или площадью поверхности для всех моделей остеоцитов, как показано в таблице 1. Возрастной остеоцит (модель 2) и моделируемый остеоцит среднего возраста (модель 4) с наименьшей плотностью каналикулярных каналов имели наименьшую площадь лакунарно-каналикулярной поверхности 1372,7мкм2 и 1122,6мкм2. Модель 2 и модель 4 также имели наименьший объем лакунарно-каналикулярного пространства — 229,4мкм3 и 203,5мкм3 соответственно, что можно коррелировать с их низким количеством FFSS. Модель 6, с наибольшим диаметром дендрита, имела наибольшую лакунарно-каналикулярную площадь поверхности. Модель 8 имела самый большой объем лакунарно-каналикулярного пространства и наибольшие значения FFSS.

figure-results-1
Рисунок 1: Одиночные конфокальные изображения поперечного среза бедренной кости, окрашенной FITC, полученные с помощью масляных объективов 5x, 20x и 100x. Лакунарно-каналикулярная сеть видна на изображении, сделанном с объективом 100x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Конфокальные модели на основе изображений молодого (модель 1) и старого (модель 2) остеоцитов, полученных из окрашенной FITC бедренной кости 4-месячной и 22-месячной мыши C57BL6. Увеличенное изображение показывает толщину лакунарно-каналикулярного (ЛК) для молодого остеоцита и такую же для старого остеоцита. Изображение модели 1 было изменено с разрешения Niroobakhsh et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Шесть моделей остеоцитов, разработанных на основе модели 1 с использованием метода модификации геометрии. Плотность каналов была уменьшена для создания Модели 3 (моделируемой модели среднего возраста) и Модели 4 (моделируемой старости), в то время как диаметр дендрита и толщина LC были такими же, как и в Модели 1. Модель 5 и Модель 6 были разработаны с той же плотностью каналов и толщиной LC, что и Модель 1, при этом диаметр их дендритов был в два и четыре раза больше, чем у Модели 1. Модель 7 и Модель 8 имели в два и четыре раза большую лакунарно-канальную толщину соответственно, в то время как плотность каналов и диаметр дендритов остались такими же, как и в Модели 1. Изображение модели 1 было изменено с разрешения Niroobakhsh et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: 3D-вид на основе конфокального изображения модели молодого остеоцита. 3D-вид площади поперечного сечения модели молодого остеоцита на основе конфокального изображения, изображающей моделирование лакунарно-каналикулярного пространства, которое используется для анализа жидкости вокруг остеоцита и дендритов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Распределение FFSS для всех моделей остеоцитов показывает зависимость величины FFSS от морфологии остеоцитов. Красные области показывают самые высокие значения FFSS, особенно на дендритных мембранах, а не на теле клеток остеоцитов. Это изображение было изменено с разрешения Niroobakhsh et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

МоделиПлощадь лакунарно-каналикулярной поверхности (мкм2)Объем лакунарно-каналикулярного пространства (мкм3)Пр-т ФФСС (Пенсильвания)
Модели остеоцитов на основе конфокальных изображенийМодель 12652.92610.42
Детеныши (4 месяца)
Модель 21372.7229.40.19
В возрасте (22 месяца)
Моделируемые модели остеоцитов, созданные с использованием метода модификации геометрииМодель 31530.4242.60.27
(Симуляция среднего возраста)
Модель 41122.6203.50.13
(Симулированный состаренный)
Модель 53724.9302.90.49
(2 x диаметр дендрита)
Модель 647913370.57
(4 x диаметр дендрита)
Модель 73116.3440.61.17
(2 x толщина LC)
Модель 83542.2658.21.89
(4 x толщина LC)

Таблица 1: Сравнение моделей остеоцитов. Сравнение среднего значения FFSS, объема лакунарно-каналикулярного пространства и площади поверхности в восьми различных моделях остеоцитов, включая две модели на основе конфокальных изображений и шесть модели, сгенерированных на основе модели 1 с использованием метода модификации геометрии.

Обсуждение

Этот протокол описывает метод конфокальной визуализации для визуализации и компьютерного моделирования остеоцитов. Перед конфокальной визуализацией выполняется процесс подготовки кости к срезу и окрашиванию образцов кости. Конфокальные изображения 100-кратного увеличения импортируются в различные программы для разработки компьютерных моделей остеоцитов и лакунарно-каналикулярного пространства. Наконец, CFD-анализ проводится на моделях на основе конфокальных изображений для моделирования FFSS, окружающих остеоциты и дендритные мембраны, из-за физической активности, что технически сложно in vivo из-за недоступности остеоцитов в костном матриксе. Предоставленный протокол также полезен при определении других напряжений или деформаций с использованием метода конечных элементов или взаимодействия жидкости и структуры (FSI) в мультифизическом моделировании.

Конфокальная визуализация была использована для визуализации LCN 7,9,24,25 из-за изображений с высоким разрешением, которые могут быть получены с помощью окрашивания кости FETC. Несмотря на то, что диаметр каналикул близок к пределу разрешения микроскопа, можно получить надежные конфокальные изображения каналикулов, которые могут охватить большую часть каналикулов. Из-за меньшего диаметра дендритов остеоцитов технически сложнее точно получить изображения дендритов. Поэтому был разработан полезный метод моделирования остеоцитов и дендритов по конфокальным изображениям LCN путем уменьшения их объема с помощью операции сглаживания в программном обеспечении. В некоторых других опубликованных исследованиях использовался аналогичный подход для компенсации LCN для создания остеоцитарно-дендритной мембраны9. Другое преимущество метода сглаживания заключается в улучшении некоторых ошибок визуализации в CLSM, таких как удлинение диаметра канала, которое происходит по оси Z из-за более низкого разрешения изображения по оси Z, что является особенностью оптической визуализации. Деконволюция также считается альтернативным методом уменьшения оптического растяжения в направлении Z, поскольку она улучшает соотношение сигнал/шум в исходном наборе данных. Лакунарно-каналикулярное пространство моделируется на основе LCN и остеоцитарно-дендритных мембран для анализа профиля жидкости внутри LCN.

Примечательно, что по отношению к существующим методам была введена новая методика разработки моделей остеоцитов с модифицированной геометрией, не жертвуя при этом еще одной мышью. Метод изменения геометрии также помогает смоделировать изменение микроструктуры кости из-за старения или заболеваний костей, таких как остеопороз, диабет и такие состояния, как дефицит перлекана и т. д. В этом методе модель остеоцитов молодой мыши на основе конфокального изображения была использована для моделирования морфологии старых или других костных остеоцитов путем изменения таких параметров, как плотность каналов, лакунарно-каналикулярное пространство и диаметр дендрита. Этот подход был подтвержден сходством двух старых моделей остеоцитов, одна из которых была получена с помощью конфокального моделирования реального остеоцита 22-месячной мыши, а другая была получена с помощью моделирования модификации геометрии остеоцита, первоначально полученного от 4-месячной мыши путем уменьшения плотности его каналикуляров. Эти две старые модели остеоцитов показали схожую величину FFSS, которая была самой низкой среди всех моделей остеоцитов. Метод модификации геометрии может иметь множество применений в различных биологических областях, поскольку он может предсказывать результаты, сопоставимые с моделями остеоцитов, созданными с использованием реальных остеоцитов животного. Некоторые из ограничений этой работы включают потерю некоторых деталей шероховатости поверхности из-за метода сглаживания и тот факт, что диаметры каналикулов находятся на пределе разрешения конфокальных микроскопов, что потенциально может привести к некоторой неточности для каналикулов с меньшими диаметрами, а также идеализацию потока жидкости вместо моделирования с использованием колебательного потока.

Чтобы продемонстрировать функциональность метода, были измерены значения FFSS остеоцитов для различных моделей остеоцитов, полученных от молодой и старой мыши или с использованием метода модификации геометрии. Одним из заслуживающих внимания открытий с использованием этих компьютерных моделей было то, что объем лакунарно-каналикулярного пространства прямо пропорционален среднему FFSS, испытываемому остеоцитами. Это новое открытие, которое ранее не исследовалось, может иметь различные применения в определении механочувствительности остеоцитов, поскольку оно может коррелировать морфологию сети остеоцитов с обнаруженным FFSS остеоцитами и их процессами.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Национальному научному фонду (NSF, номер награды NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), Национальному институту здравоохранения (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) и (NIH/SIG S10OD021665 и S10RR027668 PI: SL Dallas), а также Программе исследовательских грантов Школы последипломного образования Университета Миссури-Канзас-Сити.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наждачная бумага с зернистостью 1 200Buehler30-5170-012-100
Программное обеспечение 3-MaticMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-maticПрограммное обеспечение для оптимизации 3D-данных
зернистостью 600 Наждачная бумага с зернистостью 600 Наждачная бумага с зернистостьюBuehler
Программное обеспечениеANSYSANSYShttps://www.ansys.com/обеспечение для моделирования
флуоресцеина изотиоцианата (FITC)Sigma-AldrichF7250
Программное обеспечениеhttps://imagej.net/ij/
Иммерсионное масло для микроскоповLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II конфокальный микроскоп Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Алмазная пила Leitz 1600 с внутренним отверстиемLeica 
Программное обеспечение MIMICS Innovation SuiteMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suiteПрограммное обеспечение для обработки 3D-изображений
Permount Mount Mountmedium Fisher scientificSP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic KitBuehler20-3560
Одноплатформенный лабораторный шейкерReliable scientific INCМодель 55С
с 30-5170-800-100 программное ImageJ

Ссылки

  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи