Отслеживание динамики структурных вариантов в экспериментально эволюционировавших популяциях

Summary

Мы разработали экономически эффективный метод отслеживания динамики аллелей неоднонуклеотидного полиморфизма, который может быть легко адаптирован к экспериментальным эволюционным замороженным архивам. Метод триплетной ПЦР сочетался с автоматическим параллельным капиллярным электрофорезом для количественной оценки относительной частоты аллеля вставки в ходе экспериментальной эволюции.

Abstract

В настоящее время известно, что структурные варианты (SV) (т. е. делеции, вставки, дупликации и инверсии) играют важную роль в фенотипической изменчивости и, следовательно, в таких процессах, как определение заболевания или адаптация к новой среде. Однако однонуклеотидным вариантам уделяется гораздо больше внимания, чем SV, вероятно, потому, что их легче обнаружить, а их фенотипические эффекты легче предсказать. Развитие технологий глубокого секвенирования с короткими и длинными показаниями значительно улучшило обнаружение SV, но количественная оценка их частоты на основе данных объединенного секвенирования (poolseq) по-прежнему технически сложна и дорогостояща.

Здесь мы представляем довольно простой и недорогой метод, который позволяет исследователям проследить динамику частоты аллелей SV. В качестве примера применения мы следуем частоте вставки последовательности вставки (IS) в экспериментальных эволюционных популяциях бактерий. Этот метод основан на проектировании триплетов праймеров вокруг границ структурных вариантов, таким образом, чтобы ампликоны, полученные при амплификации дикого типа (WT) и производных аллелей, отличались по размеру не менее чем на 5% и чтобы их эффективность амплификации была одинаковой. Количество каждого ампликона затем определяется с помощью параллельного капиллярного электрофореза и нормализуется до калибровочной кривой. Этот метод может быть легко распространен на количественную оценку частоты других структурных вариантов (делеций, дупликаций и инверсий) и на подходы пул-секвенирования природных популяций, включая популяции патогенов внутри пациента.

Introduction

Структурные варианты (SV) представляют собой изменения геномной последовательности, обычно влияющие на 50.н. или более. Четыре категории описанных SV — это большие вставки, большие удаления, инверсии и дублирования. До недавнего времени больше внимания уделялось однонуклеотидным вариантам (SNV), чем структурным вариантам, с точки зрения их фенотипических эффектов и их роли в качестве генетических детерминант заболевания или их вклада в адаптацию. Вероятно, это связано с тем, что легче как обнаружить SNV, так и предсказать их фенотипические эффекты. Тем не менее, технологии глубокого секвенирования с коротким и длинным считыванием значительно улучшили обнаружение SV, по крайней мере, в отдельных индивидуумах или клональных геномах¹. Параллельно с этим их фенотипические эффекты были лучше охарактеризованы, и было задокументировано множество примеров их влияния в качестве генетических детерминант болезней человека ^2,3 или адаптации к новой среде⁴.

Делеции и вставки, часто вызванные вставками мобильных генетических элементов (MGE), гораздо более разрушительны, чем однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), и приводят к мутациям со сдвигом рамки и модификации структуры белка. Делеции и вставки MGE в генах почти всегда приводят к инактивации генов, а вставки в некодирующие области могут приводить к репрессии или конститутивной экспрессии соседних генов, когда последовательности вставки (IS) содержат промоторные или терминирующие последовательности⁵. В то время как нокаут основных генов приводит к явным пагубным последствиям для бактериальной приспособленности, потеря второстепенных генов в некоторых случаях полезна. Несмотря на присущие им затраты, дупликации также могут быть полезными и участвовать в адаптации, поскольку они приводят к изменению дозировки генов; Увеличение активности определенного белка может быть полезным в зависимости от условий⁶.

Микробные экспериментальные эволюционные популяции обычно начинаются с клонов. Это первоначальное отсутствие генетического разнообразия в сочетании с «закрытой средой», характерной для пробирок, приводит к очень ограниченному потенциалу эволюции путем получения генов посредством горизонтального переноса и рекомбинации генов. В этих специфических условиях особенно важен вклад в адаптацию делеций, дупликаций и внутригеномной вставки MGE; бактерии часто приспосабливаются через мутации с потерей функции (в основном из-за делеций или вставок MGE), влияя на гены, которые бесполезны в стабильных, часто богатых питательными веществами, монокультурных искусственных средах⁷. В самом продолжительном эксперименте по эволюции E. coli вставки IS150 особенно часты среди популяций, эволюционировавших после 50 000 поколений, при этом элементы IS составляют 35% мутаций, которые достигают высокой частоты в популяциях, которые сохраняют частоту мутаций в предковой точке⁸.

Исследования эволюции и ресеквенирования сочетают экспериментальную эволюцию и технологии секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения того, как бактерии адаптируются на фенотипическом и геномном уровнях к различным условиям окружающей среды и стрессам, таким как различные источники углерода и энергии, антибиотики и осмотический стресс 9,10,11 . Эти исследования обычно получают геномную информацию об эволюционировавших популяциях или клонах исключительно в экспериментальной конечной точке, а в некоторых случаях и в ряде промежуточных временных точек^12,13,14. Эти данные дают представление о генах и путях, участвующих в адаптации к данной среде, но редко позволяют исследователям проследить динамику de novo возникающих и охватывающих аллелей с течением времени.

Один из подходов к отслеживанию этой динамики состоит в том, чтобы выбрать ограниченное количество сегрегационных аллелей, представляющих интерес (из-за функции генов, на которые они влияют, потому что они проходят параллельно в независимых популяциях и т. д.) и использовать секвенирование ампликонов для количественной оценки доли аллелей, объединяя множество временных точек в одном и том же цикле^{секвенирования 15}. Этот метод был успешно использован для отслеживания динамики вариантов малых размеров (SNP или 1.н.) в экспериментальных¹⁶ и естественных¹⁷ популяциях микробов. Однако в случае более крупных инделов или вставок MGE разница в размерах ампликонов вызывает различия в эффективности ПЦР, которые искажают взаимосвязь между пропорциями считывания и аллеля. В некоторых случаях разница в размерах между двумя аллелями превосходит классическую длину ампликона. Здесь мы соединили метод триплетной ПЦР с автоматическим параллельным капиллярным электрофорезом для количественной оценки относительной частоты аллеля вставки на основе дискриминации по размерам. Этот подход позволяет использовать недостаточно используемые экспериментальные временные точки для определения динамики возникающего мутантного аллеля и отслеживать его частоту до фиксации или потери экономически эффективным способом. Мы применили этот метод для отслеживания возникающих ^{мутS-аллелей}, мутировавших через вставку IS10, обеспечивая мутировавший генотип гипермутаторным фенотипом.

Этот метод требует двух целевых аллелей с разницей в размере ≥5%. Во-первых, триплеты грунтовки предназначены для получения фрагментов одинакового размера, которые имеют общий праймер. Во-вторых, оптимизируются условия ПЦР и строится калибровочная кривая с использованием смесей дикого типа (WT) и мутантной гДНК. Наконец, образцы амплифицируются с помощью ПЦР, а относительная частота каждого аллеля количественно определяется с помощью параллельного количественного капиллярного электрофореза.

Protocol

Настройка этого протокола требует точного знания точки вставки, удаления, инверсии или дублирования в наследственной последовательности. Эта информация обычно получается путем полногеномного секвенирования (WGS) конечных или промежуточных точечных образцов. В следующем протоколе общий принцип для случая инсерционной мутации приведен для каждого этапа, наряду с репрезентативным случаем, когда соблюдается частота вставки IS10 в ген mutS в экспериментальной эволюционной популяции E. coli. В этой популяции WGS популяции конечных точек идентифицировала вставку 1,329.н. IS10 между позициями 2,463 и 2,471, что привело к дублированию этого сайта вставки. Этот метод применим к трем другим типам SV, и особенности каждого случая приведены в обсуждении.

1. Проектирование триплетных грунтовок

1. Используйте классические методы проектирования грунтовок (18-24.н., содержание GC 40%-60%, начало/конец с парами G/C, где это возможно, разница_Tm < 5 °C) для производства грунтовок FW1 и RV1. Разработка праймеров для амплификации короткого ампликона на аллеле WT вокруг сайта вставки мутантного аллеля (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ампликона может варьироваться от 100.н. до 3000.н., в соответствии с лестницей размеров ДНК, используемой в капиллярном электрофорезе. В этом примере ампликон 155.н. был усилен. Малый размер фрагмента, выбранный здесь, предотвращает нецелевое усиление всей последовательности вставки IS10 (см. раздел 2).
2. Разработайте второй прямой праймер FW2 в последовательности введения, чтобы получить второй ампликон, который примерно на 5% больше или меньше, чем ампликон WT (рис. 1). Эта разница в размерах 5% является минимальной разницей в размерах, которую устройство для параллельного капиллярного электрофореза может надежно различить. Поэтому спроектируйте праймеры таким образом, чтобы два ампликона имели разницу в размерах, которая выше, но как можно ближе к относительному порогу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно сведите к минимуму разницу в_Tm и образование димера праймера. В этом примере второй прямой праймер был разработан для получения ампликона 226.н., что на 71.н. больше, чем ампликон WT. В этом репрезентативном примере последовательности праймеров выглядят следующим образом:
   FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

Рисунок 1: Схема дизайна триплетного праймера на ген mutS WT и вставка мутантного mutS IS10. Черный треугольник представляет собой сайт вставки IS10 в гене mutS. Ген WT окрашен в синий цвет, а IS10 — в оранжевый. Праймеры FW1 и RV1 помечают место введения IS10 и дают ампликон WT 155.н. Праймер RV1 и внутри-IS10 праймер FW2 дают второй ампликон 226.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Оптимизация условий ПЦР

1. Вырастите за одну ночь культуру фиксированных клонов WT и мутантных аллелей.
2. Извлеките ДНК с помощью любого набора.
3. Количественно оцените ДНК.
4. Подготовьте образец ДНК, разбавив экстракцию WT и мутантной ДНК до 5 нг/мкл. Смешайте два образца ДНК в соотношении 50/50.
5. Амплифицируйте 10 нг из трех образцов ДНК (WT, мутантный, смесь 50/50) с использованием 2-кратной готовой к использованию мастер-смеси для ПЦР, праймера FW1 0,5 мкМ, праймера RV1 1 мкМ и праймера FW2 0,5 мкМ в реакционном объеме 20 мкл. Используйте 2% агарозный гель для миграции продукта ПЦР с помощью классического электрофореза и определения оптимальных условий ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время удлинения должно быть сведено к минимуму, чтобы предотвратить образование ампликонов FW1 и RV1 на мутантном аллеле. Температуру отжига следует регулировать, чтобы свести к минимуму смещенную амплификацию аллелей и неспецифическую амплификацию.
   1. Чтобы следовать программе в этом примере, используйте следующие настройки: 98 °C в течение 10 с, затем 25 циклов 98 °C в течение 1 с, 58 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 8 с и последний этап удлинения при 72 °C в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время удлинения было уменьшено до 8 с, чтобы предотвратить амплификацию продукта >1,000 п.н. из прямого праймера и праймера RV1 на мутантный аллель (mutS со вставкой IS10).

3. Калибровочная кривая

1. Смешайте два образца ДНК, WT и мутантный, в соотношениях 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 и 90/10.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биологические реплики получают из независимых бактериальных культур в течение ночи.
2. Амплификация с использованием оптимизированных условий ПЦР (см. раздел 2).
3. Количественно оцените произведение ампликона.
4. Разбавьте продукты ПЦР до 0,1 нг/мкл.
5. Подготовьте прибор для параллельного капиллярного электрофореза.
   1. Смешайте свежий гель и краситель (набор для количественного анализа NGS (22, 33 или 55); HS NGS фрагмент 1-6,000.н. для этого примера).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции см. в руководстве по фрагментам параллельного капиллярного электрофореза HS NGS (см. Таблицу материалов).
6. Замените раствор для хранения капилляров и входной буфер и поместите буферную пластину для промывки в правильные места ящиков прибора для параллельного капиллярного электрофореза.
7. Добавьте 2 мкл маркера разбавителя HS к 22 мкл каждого разбавленного образца в 96-луночном планшете.
8. Добавьте размерную лестницу (лестница размера ДНК; диапазон 1-6000.н.) из набора для количественного анализа HS NGS в одну скважину 96-луночного планшета.
9. Поместите пластину с 96 лунками в правильный ящик прибора для параллельного капиллярного электрофореза и выберите «Выполнить » в программном обеспечении прибора для параллельного капиллярного электрофореза.
10. Проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения для анализа данных, которое обнаруживает и идентифицирует каждый пик лестницы размеров, присваивая каждый пик образцов их известному фактическому размеру.
    1. При использовании количественного набора используйте программное обеспечение для определения количества ДНК каждого фрагмента путем интегрирования области под пиком, как при анализе данных хроматографии. Опять же, сравните образцы с известными количествами в стандартах, чтобы количественно оценить каждый пик из образца, и рассчитайте соотношения между различными пиками, обнаруженными в образцах.
    2. Постройте калибровочную кривую (рис. 2), связывающую известную долю мутантного аллеля (смеси ДНК) с той, которая измеряется с помощью прибора для параллельного капиллярного электрофореза. Эта калибровочная кривая позволяет оценить надежность метода и скорректировать его на незначительную погрешность усиления.

4. Пробоподготовка

1. Выращивайте образцы за ночь в стандартных условиях.
2. Извлеките ДНК.
3. Количественно оцените ДНК.
4. Амплифицируйте образцы, используя оптимизированные условия ПЦР (см. раздел 2).
5. Запустите образцы в приборе для параллельного капиллярного электрофореза (см. шаги 3.5-3.10).

5. Количественная оценка аллелей

1. Извлеките количества мутантных аллелей из данных прибора для параллельного капиллярного электрофореза с помощью программного обеспечения и рассчитайте фактические пропорции, нанеся эти значения на калибровочную кривую.

Results

Используя ДНК, извлеченную из предкового клона, и клона гипермутатора, выделенного из популяции S2.11 в поколении 1000, мы установили калибровочную кривую, показанную на рисунке 2. Фактические мутантные пропорции из подготовленных в лаборатории смесей ДНК и измеренные с помощью прибора для параллельного капиллярного электрофореза, были связаны линейной зависимостью наклона 1,0706 с^R2 0,9705. Кроме того, было достигнуто хорошее согласие между биологическими репликами; Стандартное о...

Discussion

Здесь мы предложили экономически эффективный метод, который позволяет проследить динамику возникающих адаптивных аллелей SV в экспериментальных эволюционных популяциях. Этот метод сочетает в себе классические методы ПЦР и автоматизированный параллельный капиллярный электрофорез, что позволяет определить относительные количества двух аллелей. После настройки он позволяет количественно определять пропорции аллелей во многих образцах параллельно и намного дешевле, чем WGS. Этот метод можно рассматривать как эквивалент секве...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Хорошо окаймленный ПЦР-планшет	4titude	4Ti - 0740	ПЦР
Агароза молекулярная биология класса	Eurogentec	EP-0010-05	Электрофорез в агарозном геле
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Краткое руководство по системам анализа фрагментов	Agilent		PDF Руководство по эксплуатации
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Электрофорез в агарозном геле
Калиброванные одноразовые инокуляционные петли и иглы	LABELIANS	8175CSR40H	Бактериальная культура
Набор для крови и тканей Dneasy	Qiagen	69506	Экстракция ДНК
Электрофорез	Источник питания Amilabo	ST606T	Электрофорез в агарозном геле
Анализатор фрагментов Автоматизированная система CE	Agilent		Параллельный капиллярный электрофорез
Фрагмент ДНК Лестница	Agilent	DNF-396, диапазон 1-6000.н.	Параллельный капиллярный электрофорез
ГЕНТАМИЦИНА СУЛЬФАТНАЯ СОЛЬ БИОРЕАГЕНТ	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Бактериальная культура
Высокочувствительный разбавитель маркера	Agilent	DNF-373	Параллельный капилляр электрофорез
Высокочувствительный набор для количественного анализа NGS	Agilent	DNF-474	Параллельный капиллярный электрофорез
Лестница быстрой загрузки 1 kb плюс лестница ДНК	NEB	N0469S	Электрофорез в агарозном геле
LB Бульон, ВегитонNutriSelect Plus	Millipore	28713	Бактериальная культура
Мастер Микс ПЦР Высокая точность Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Праймеры	Eurogentec		PCR
Prosize программное обеспечение для анализа данных v.4	Agilent	V.4	Параллельный капиллярный электрофорез
Qubit анализы	Invitrogen	MAN0010876	Quantification
DNA Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Quantation DNA
Thermocycler	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose gel электрофорез визуализация
Вода для инъекционного препарата	Aguettant	PROAMP	PCR