Оптимизированные методы поверхностной иммобилизации коллагенов и анализов связывания коллагена

Summary

В данной работе представлен оптимизированный протокол для воспроизводимой иммобилизации и количественного определения коллагена I и III типа на микропланшетах с последующим улучшенным протоколом анализа связывания in vitro для изучения взаимодействий коллагена и соединения с использованием флуоресцентного метода с временным разрешением. Обеспечивается последующий пошаговый анализ и интерпретация данных.

Abstract

Фиброз возникает в различных тканях как репаративная реакция на травму или повреждение. Однако при чрезмерном распространении фиброз может привести к рубцеванию тканей и отказу органов, что связано с высокой заболеваемостью и смертностью. Коллаген является ключевым фактором фиброза, при этом коллаген I и III типов является основным типом, участвующим во многих фиброзных заболеваниях. В отличие от обычных протоколов, используемых для иммобилизации других белков (например, эластина, альбумина, фибронектина и т.д.), комплексные протоколы для воспроизводимой иммобилизации различных типов коллагенов с целью получения стабильных покрытий не всегда доступны. Иммобилизация коллагена удивительно сложна, потому что на эффективность иммобилизации могут повлиять несколько экспериментальных условий, включая тип коллагена, pH, температуру и тип используемой микропластины. Здесь представлен подробный протокол воспроизводимой иммобилизации и количественного определения коллагенов I и III типов, что приводит к получению стабильных и воспроизводимых гелей/пленок. Кроме того, в данной работе показано, как проводить, анализировать и интерпретировать in vitro исследования флуоресцентного связывания с временным разрешением для изучения взаимодействий между коллагенами и потенциальными коллаген-связывающими соединениями (например, пептидом, конъюгированным с хелатом металла, несущим, например, европий [Eu(III)]). Такой подход может быть универсально применен в различных биомедицинских приложениях, включая область молекулярной визуализации для разработки целевых зондов визуализации, разработки лекарств, исследований клеточной токсичности, исследований клеточной пролиферации и иммунологических анализов.

Introduction

Накопление фиброзной соединительной ткани в рамках естественного процесса заживления ран после повреждения тканей известно как фиброз. Однако, если отложение фиброзной ткани не прекращается и продолжается сверх того, что необходимо для восстановления тканей, то фиброз становится чрезмерным ^1,2. Чрезмерный фиброз ухудшает физиологию и функцию органов и может привести к повреждению органов и потенциальной органной недостаточности ^3,4,5. Двумя основными факторами фиброза являются белки внеклеточного матрикса (ВКМ): коллаген I типа и тип III⁶. Коллаген – это структурный белок, содержащийся в различных органах, который составляет примерно одну треть от общего содержания белка в организме^{человека1}. Существует 28 различных типов коллагенов, идентифицированных с помощью секвенирования генома человека, и наиболее распространенными являются фибриллярные коллагены⁷. Первичным фибриллярным коллагеном является коллаген I типа, который обеспечивает ECM прочность на разрыв и устойчивость к деформации⁸. Коллаген III типа является структурным компонентом, который обеспечивает эластичность и колокализуется с коллагеном I типа. Он экспрессируется во время эмбриогенеза и естественным образом обнаруживается в небольших количествах в коже, мышцах и кровеносных^{сосудах} взрослого человека.

Синтез коллагена in vivo начинается с внутриклеточного процесса, в котором мРНК транскрибируется в ядре, а затем перемещается в цитоплазму, где транслируется. После трансляции образовавшаяся цепь подвергается посттрансляционной модификации в эндоплазматическом ретикулуме, где образуется проколлаген (предшественник коллагена). Затем про-коллаген перемещается в аппарат Гольджи для окончательной модификации перед тем, как быть выведенным во внеклеточное пространство¹⁰. Посредством протеолитического расщепления проколлаген трансформируется в тропоколлаген. Затем он сшивается либо через ферментативно-опосредованный путь сшивания, катализируемый ферментом лизилоксидазой (LOX), либо через неферментативно-опосредованный путь сшивания, включающий реакцию Майяра¹¹. Протоколы in vitro по иммобилизации коллагена в основном полагаются на способность коллагена к самосбору. Коллаген извлекается из тканей на основе его растворимости, которая во многом зависит от степени сшивки отдельных коллагеновых фибрилл⁷. Фибриллярный коллаген растворяется в уксусной кислоте, и фибриллы могут восстанавливаться при регулировке рН и температуры¹². In vitro фибриллогенез коллагена можно рассматривать как двухэтапный процесс⁷. Первая стадия — это фаза зародышеобразования, когда коллагеновые волокна образуют димеры и тримерные фибриллы, прежде чем они перестраиваются в тройную спиральную структуру. Вторая фаза – это фаза роста, когда фибриллы начинают расти латерально, что приводит к образованию характерной D-полосы, которая обычно наблюдается по изменениям^{мутности7}. Исследования атомно-силовой микроскопии (АСМ) также показали, что коллаген I и III типов имеет разные характеристики (Таблица 1^).

Чтобы изучить связывающие взаимодействия между коллагеном и другими соединениями, коллаген необходимо воспроизводимо иммобилизовать в лунках микропланшетов. Существуют различные протоколы иммобилизации растворимого коллагена 14,15,16. Коммерчески доступные микропланшеты, которые предварительно покрыты коллагеном, обычно используются для культивирования клеток. Тем не менее, микропланшеты с предварительно покрытым покрытием имеют очень тонкий слой неизвестного количества коллагена, покрытый лунками, что делает их непригодными для анализов связывания in vitro. Существует несколько проблем при иммобилизации коллагена в лунках пластины. Одной из ключевых сложностей является выбор подходящего типа микропланшета, ведь разные виды коллагенов (например, I и III типа) имеют разные химические свойства и, следовательно, иммобилизуются более стабильно и эффективно в зависимости от материала микропланшета. Еще одной проблемой являются экспериментальные условия протокола иммобилизации, поскольку процесс фибриллогенеза зависит от множества факторов, включая температуру, pH, исходную концентрацию коллагена и ионную концентрацию буфера^.

Для изучения взаимодействий между коллагеном (мишенью) и другими соединениями (т.е. пептидом-мишенью) также необходимо разработать надежный скрининговый анализ для исследования специфичности и селективности соединения по отношению к мишени путем измерения константы диссоциации, K_d. Положение равновесия образования бимолекулярного комплекса между белком (коллагеном) и лигандом выражается в терминах ассоциативной константы K_a, величина которой пропорциональна аффинности связывания. Тем не менее, чаще всего биохимики выражают аффинные отношения в терминах равновесной константы диссоциации K_d бимолекулярного комплекса, которая определяется как K_d = 1/K_a (K_d и является обратной K_a). Чем ниже значение K_d, тем сильнее прочность связи между белком и лигандом. Преимущество использования K_d для сравнения аффинности связывания различных лигандов к одному и тому же белку (и наоборот) связано с тем, что единицами K_d для бимолекулярного комплекса являются моль/л (т.е. единица концентрации). В большинстве экспериментальных условий значение K_d соответствует концентрации лиганда, что приводит к 50% насыщению имеющихся сайтов связывания на мишени в равновесии^17,18. Константу диссоциации обычно извлекают путем анализа фракционной занятости рецептора (FO), которая определяется как отношение между занятыми сайтами связывания и общим количеством доступных сайтов связывания в зависимости от концентрации лиганда. Это может быть сделано при условии наличия аналитического анализа, способного различить и измерить количество связанного лиганда.

Анализ связывания лиганда in vitro может быть выполнен с использованием различных биоаналитических методов, включая оптическую фотометрию, методы радиолиганда, масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Среди фотометрических методов, основанных на флуоресцентном излучении, обычно требуется мечение лигандов или белков флуорофорами для повышения чувствительности и улучшения предела обнаружения в анализе. Хелаты некоторых ионов лантаноида(III), таких как Eu(III), очень привлекательны в качестве флуорофоров, поскольку они имеют большие сдвиги Стокса, узкие полосы излучения (обеспечивающие хорошее соотношение сигнал/шум), ограниченное фотообесцвечивание и длительный срок службы излучения. Важно отметить, что последнее свойство позволяет использовать флуоресценцию с временным разрешением (TRF) из флуорофоров Eu(III) для отмены фоновой автофлуоресценции¹⁹. В версии TRF-анализа на основе Eu(III) с помощью флуоресцентного иммуноферментного анализа (DELFIA) с использованием диссоциативных лантаноидов лиганды, меченные нелюминесцентным хелатом Eu(III), инкубируются с иммобилизованным рецептором на микропланшетах. Меченый комплекс лиганд/рецептор отделяют от несвязанного лиганда, и флуоресценцию Eu(III) активируют диссоциацией комплекса Eu(III) при кислом pH, с последующим повторным комплексообразованием с помощью хелатора, усиливающего флуоресценцию, с образованием встроенного в мицеллы высокофлуоресцентного комплекса Eu(III)²⁰.

Стадия декомплексации может быть разумно достигнута с помощью хелататоров, таких как диэтилентриамина пентаацетат (DTPA), которые демонстрируют быструю кинетику декомплексации. Тем не менее, комплексы Eu(III) с некоторыми макроциклическими хелаторами, такими как DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан1,4,7,10-тетрауксусная кислота) и его производные моноамида (DO3AAm), демонстрируют высокую термодинамическую стабильность и очень высокую кинетическую инертность. В этом случае этапы декомплексообразования должны быть точно оптимизированы для достижения достаточной и воспроизводимой активации TRF²¹ на основе Eu(III). Стоит отметить, что комплексы лантаноидов (Ln(III))-DOTA и Ln(III)-DO3AAm чаще всего используются в качестве контрастных веществ для молекулярной визуализации in vivo с помощью методов магнитно-резонансной томографии (МРТ)²². Таким образом, TRF-анализ на основе Ln(III) является предпочтительным инструментом для изучения in vitro аффинности связывания молекулярных зондов МРТ с их предполагаемыми биологическими мишенями. В настоящее время отсутствуют всеобъемлющие и воспроизводимые протоколы иммобилизации коллагена I и III типа, а также воспроизводимый конвейер для проведения экспериментов in vitro по связыванию Eu(III) TRF. Для преодоления этих ограничений были разработаны воспроизводимые методы самосборки и иммобилизации коллагена I и III типа и получения стабильных гелей и пленок соответственно с достаточной концентрацией коллагена, необходимой для анализов in vitro . Представлен оптимизированный протокол для Eu(III) TRF высокоинертных комплексов на основе Eu(III)-DO3Aam. Наконец, продемонстрирован оптимизированный in vitro анализ Eu(III) TRF на микропланшетах для измерения K_d меченых Eu(III) лигандов по отношению к иммобилизованному коллагену I и III типа (рис. 1).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся информация о продукте, используемая для этой работы, представлена в Таблице материалов.

1. Иммобилизация коллагеном

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в каждой лунке микропланшета, используемого во время анализа связывания, есть свободные соседние лунки, чтобы избежать перекрестной флуоресценции. Выполняйте эту часть протокола на льду, потому что коллаген самособирается при повышении температуры и уровня pH. Выполняйте эту процедуру в шкафу для культуры тканей и в стерильных условиях, поскольку микропланшеты впоследствии инкубируются в инкубаторе для культуры тканей (ТС).

1. Иммобилизация коллагена I типа на 96-луночных микропланшетах (Рисунок 2)
   День 1
   1. Подготовьте силиконовый лоток со льдом. Поместите флакон с коллагеном I типа, холодный 10-кратный фосфатно-солевой буфер (PBS) и микропланшеты на лед и распылите все 70% этанола. Поместите материал под колпак TC.
   2. Нейтрализуйте коллаген, используя равные объемы коллагена I типа и 10x PBS (pH 7,4).
   3. Переверните раствор несколько раз, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки.
   4. Добавьте 100 μL нейтрализованного коллагена в каждую вторую лунку и каждый второй ряд микропланшета и инкубируйте при 37 °C в течение 18-20 часов, чтобы выпарить коллаген до сухости.
      День 2
   5. Промойте микропланшеты 100 мкл 1x PBS, pH 7,4 дважды, чтобы удалить несвязанный коллаген.
   6. Перенесите микропланшеты в инкубатор при температуре 37 °C еще на 2 ч для сушки, прежде чем использовать их для дальнейших экспериментов по связыванию.
2. Иммобилизация коллагена III типа на 96-луночных микропланшетах (Рисунок 3)
   День 1
   1. Подготовьте силиконовый лоток со льдом. Поместите флакон с коллагеном III типа, холодный 10x PBS и микропланшеты на лед и сбрызните все 70% этанолом. Поместите материал под колпак TC.
   2. Нейтрализуйте коллаген, используя равные объемы коллагена III типа и 10x PBS (pH 7,4).
   3. Добавьте 70 мкл нейтрализованного коллагена в каждую вторую лунку и каждый второй ряд микропланшета и инкубируйте при 37 °C в течение 2 часов, поместив микропланшет под колпак для культуры тканей, чтобы выпарить коллаген до сухого состояния.
      День 2
   4. Промойте микропланшеты 70 мкл 1x PBS, pH 7,4 дважды, чтобы удалить несвязанный коллаген.
   5. Перенесите микропланшеты в инкубатор на 1 ч при температуре 37 °C, а затем перенесите микропланшеты на стол и дайте им высохнуть в течение 1 ч, прежде чем использовать их в дальнейших экспериментах по связыванию.

2. Оценка стабильности иммобилизованных коллагеновых гелей/пленок

1. Инкубация с PBS в течение 1 ч
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента по связыванию инкубируйте иммобилизованный коллаген с интересующим соединением. Важно исследовать стабильность полученного коллагенового геля или пленки. Для этого измерьте стабильность трех условий: no wash = измеряет иммобилизованный коллаген сразу после инкубации; wash = измеряет иммобилизованный коллаген после двукратной промывки пластины 100 μл PBS; и 1 ч PBS имитирует и промывает = измеряет иммобилизованный коллаген после инкубации в течение 1 ч с PBS с последующим двумя промывками PBS. Ниже поясняется метод инкубации PBS.
   1. Добавьте 70 мкл PBS (1x) в каждую из лунок, покрытых коллагеном, и инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 1 часа.
   2. Отберите лишнюю жидкость из каждой лунки с помощью пипетки и дважды промойте PBS (1x) перед проведением количественного анализа белка, описанного ниже.
2. Количественная оценка количества иммобилизованного коллагена с помощью анализа бицинхониновой кислоты (БЦА)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для анализа белка Pierce BCA (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Составьте соответствующие стандарты коллагена для этого анализа. Диапазон концентраций коллагена I составляет от 0 до 3 000 г/мл, а коллагена III от 0 до 750 г/мл. Всего сделайте 11 норм на один коллаген.
   1. Подготовьте общий необходимый объем рабочего реагента (WR), следуя инструкциям производителя.
   2. Добавьте по 25 мкл каждого стандарта коллагена в лунки микропланшетов (в двух экземплярах). Эти решения используются для построения стандартной кривой.
   3. Добавьте по 200 мкл рабочего раствора реагента в каждую из лунок, содержащих стандарты, и лунки, покрытые коллагеном в неизвестных концентрациях.
   4. Поместите микропланшет на шейкер для тарелок на 30 секунд. Накройте микропланшеты крышкой и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
   5. Выньте микропланшеты и дайте остыть при комнатной температуре. Измерьте поглощение на длине волны 560 нм с помощью считывателя пластин.
   6. Постройте калибровочную кривую, сопоставив A₅₆₀ (AU) с концентрацией (μг/мл) 11 стандартных растворов, и используйте калибровочную кривую для расчета количества коллагена.

3. Анализ связывания лиганда Europium(III) TRF (Рисунок 1)

Примечание: Используемое соединение представляет собой кандидат в виде коллаген-связывающего пептида (CBP), меченного одним комплексом Eu(III)-DO3AAm, называемым Eu(III)-DO3AAm-CBP (Рисунок 4).

1. Инкубация пластин, покрытых коллагеном, с соединением Eu(III)-DO3AAm-CBP
   1. Готовят растворы соединения Eu(III)-DO3AAm-CBP в концентрациях в диапазоне от 0,1 до 15 мкМ (0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 5 мкМ, 7 мкМ, 10 мкМ и 15 мкМ) в 1x PBS.
   2. Добавьте 75 мкл соединения каждой концентрации в лунки, покрытые коллагеном (пластина А). Проведите эксперимент в трех экземплярах, чтобы рассчитать количество соединения, которое связывается с коллагеном.
   3. Используйте вторую пластину без покрытия (пластина B) и добавьте по 75 мкл каждого соединения в пустые лунки, чтобы рассчитать неспецифическое связывание соединения с пластиной. Используйте тройные частоты для каждой концентрации.
   4. Инкубируйте микропланшеты в течение 1 ч при комнатной температуре.
   5. С помощью пипетки отсадите и слейте излишки раствора из каждой лунки, а также дважды промойте лунки 1x PBS, чтобы удалить излишки, несвязанные соединения. Выполните этот шаг, используя микропластины с коллагеновым покрытием и без него.
   6. К третьему планшету без покрытия (пластина C) добавьте 10 μL того же диапазона концентраций Eu(III)-DO3AAm-CBP (в двух экземплярах). Используйте показания флуоресценции от Eu(III)-DO3AAm-CBP в растворе для построения калибровочной кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не смывайте и не отсасывайте раствор с этой пластины.
2. Кислотная экстракция европия(III) и показания флуоресценции с временным разрешением (TRF)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к дополнительной информации о приготовлении и калибровке объемов кислотного раствора (AS) и буферного раствора (BS). В данной работе объемы АС и БС, необходимые для воспроизводимого достижения оптимального рН, составили 54 мкл и 46 мкл соответственно. Выполните следующую операцию на пластине A, пластине B и пластине C.
   1. Добавьте по 54 мкл кислотного раствора (AS) в каждую лунку и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 90 минут, накрыв микропланшеты пленкой во избежание испарения. Температура и время инкубации должны тщательно контролироваться для достижения воспроизводимой декомплексации.
   2. Добавьте в каждую лунку по 46 мкл буферного раствора (BS) и осторожно встряхивайте пластину в течение 30 секунд.
   3. Добавьте 100 μL раствора для улучшения (ES) и встряхивайте пластину в течение 30 с.
   4. Подождите 30 минут, прежде чем считывать показания с помощью считывателя пластин TRF. Используйте параметры, перечисленные в таблице 2.

4. Анализ данных

1. Количественная оценка концентрации коллагена, иммобилизованного в лунках
   1. Получите уравнение калибровочной кривой A₅₆₀ (AU) в зависимости от концентрации (μг/мл) 11 стандартных растворов.
      1. Используйте показания абсорбции, полученные из лунок, содержащих нормы коллагена.
      2. Сведите в таблицу средние значения из дубликатов лунок и построите график среднего поглощения в зависимости от известных концентраций белка (коллагена) (μг/мл) для получения уравнения для стандартной кривой.
   2. Используйте значения абсорбции для расчета массы (μг) и концентрации (M) иммобилизованного коллагена.
      1. Рассчитайте средние значения абсорбции по трем лункам, содержащим иммобилизованный коллаген, и запишите стандартное отклонение.
      2. Используйте уравнение стандартной кривой, полученное из стандартной кривой коллагена (шаг 2.2.6), чтобы преобразовать абсорбцию, измеренную в лунках, покрытых коллагеном, в согласованность. Исходя из этого, рассчитайте концентрацию коллагена, который был иммобилизован в экспериментальных лунках в μг/мл.
      3. Переведите концентрацию, рассчитанную на шаге 4.1.2.2 (μг/мл), сначала в граммы/литр, а затем, исходя из молекулярной массы коллагена, в моляры (М).
      4. Наконец, рассчитайте массу коллагена, иммобилизованного в каждой лунке, разделив концентрацию на объем коллагена, добавленного в лунку (100 мкл для коллагена I типа и 70 л для коллагена III типа).
2. Расчет константы диссоциации (K_d) (Рисунок 4)
   1. Извлеките показания флуоресценции.
      1. Экспортируйте показания флуоресценции из считывателя пластин в электронную таблицу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе связывания важно учитывать потенциальное неспецифическое связывание соединения с пластиковой поверхностью пластин.
      2. Рассчитайте средние значения тройных измерений для каждой концентрации соединения для трех различных планшетов: удельные показания связывания из лунок с покрытием (пластина А), неспецифические значения связывания из лунок без покрытия (пластина В) и общее содержание Eu(III)-DO3AAm-CBP в растворе в лунках без покрытия (пластина С).
      3. Определите значения флуоресценции для связанного соединения путем вычитания показаний флуоресценции лунок без покрытия (пластина В) из показаний лунок с покрытием (пластина А).
         Уравнение 1: Определение связанной флуоресценции¹⁷:
         Связанная флуоресценция = Специфическая (лунки с покрытием) - Неспецифическая (лунки без покрытия)
      4. Постройте калибровочную кривую, используя показания меченого Eu(III) соединения в растворе (пластина C). Нанесите график полученных показаний флуоресценции в зависимости от концентрации меченного Eu(III) соединения. Выполните подгонку методом линейной регрессии.
   2. Преобразуйте показания флуоресценции в концентрации.
      1. Преобразуйте показания связанной флуоресценции (шаг 4.2.3) в концентрацию с помощью стандартной кривой флуоресценции на основе данных, полученных с использованием концентраций соединений в растворе (шаг 4.2.1.4).
         Примечание: При сравнении связывающих свойств одного соединения с различными белками-мишенями, которые иммобилизуются при различных концентрациях, последние необходимо учитывать при расчете количества соединения, связанного с мишенью (т.е. связанного соединения/белка).
      2. Разделите концентрацию связанного соединения на концентрацию белка, иммобилизованного в лунке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого расчета используйте концентрацию иммобилизованного коллагена, которая была рассчитана после инкубации лунок с PBS в течение 1 ч (так называемый эксперимент по имитации PBS; раздел 2.1 выше). Это необходимо для того, чтобы учесть потенциальные потери коллагена на этапе инкубации и промывки, которые не будут способствовать окончательному сигналу флуоресценции.
      3. Постройте график данных с помощью точечной диаграммы, на которой концентрации соединения расположены по оси x (μM), а связанное соединение/белок — по оси y.
   3. Получите значения K_d .
      1. Подгонка данных, полученных на шаге 4.2.2.3, с использованием двух возможных кинетических моделей связывания: связывания с одним сайтом и связывания с одним участком со склоном холма. Уравнения для каждой модели показаны на рисунке 6.
      2. Выберите модель, которая обеспечивает однозначную аппроксимацию с наибольшим значением R-квадрат при аппроксимации данных.
      3. Исключите выбросы (выбросы) для каждого набора показаний флуоресценции на концентрацию на пластине.
      4. Вычислите итоговое значение K_d и представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения независимых экспериментов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения надежных результатов выполните тройные измерения внутри каждой пластины и не менее трех независимых экспериментов с различными микропланшетами.
   4. Рассчитайте дробную заполняемость (FO).
      Примечание: Из уравнения 2 концентрация цели неизвестна, и, следовательно, используя алгебру и K_d из уравнения 3, получается работоспособное уравнение для вычисления дробной занятости в форме уравнения 4.
      Уравнение 2: Определение дробного заполнения¹⁷:
      
      Уравнение 3: Константа диссоциации, K_d, которая представляет собой концентрацию, при которой соединение занимает 50% мишени в равновесии¹⁷:
      
      Уравнение 4: Перестроенное уравнение для вычисления уравнения FO¹⁷:
      
      1. Рассчитайте FO с использованием независимых значений K_d , полученных для каждой отдельной пластины. Нанесите график результатов, средних и стандартных отклонений FO от концентрации соединения.
      2. Сообщайте FO со значениями в диапазоне от 0 до 1 или в процентах со значениями в диапазоне от 0% до 100%.

Results

Оценка стабильности и концентрации коллагена I и III типа, иммобилизованного в гелях/пленках
Количественную оценку концентрации коллагена, иммобилизованного в одной лунке, проводили с использованием трех различных условий: а) в лунках без промывки PBS после иммобилизации белков (без промывки); б) в лунки с промывочной стадией (дважды с ПБС) после иммобилизации для удаления любого белка, не покрытого оболочкой; в) в лунки после инкубации с PBS в течение 1 ч (имитационный эксперимент PBS). Этап имитации...

Discussion

В данной работе представлен воспроизводимый метод иммобилизации коллагена I и III типа. В нем также демонстрируется протокол сбора, анализа и интерпретации данных о связывании in vitro Eu(III) TRF для характеристики связывающих свойств лиганда-кандидата по отношению к коллагену I и III типа. Представленные здесь протоколы иммобилизации коллагена I и III типа разработаны и оптимизированы с учетом ранее опубликованных работ по фибриллогенезу коллагена I и III типов in vitro

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Gibco	14200075	Используйте это для получения 1x PBS путем разбавления в воде (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	Используйте это для получения 1x PBS путем разбавления в воде (1:10)
2M HCL			Сделано на месте и подробности находятся в сопроводительном документе
2M HCL			Сделано на собственном производстве и подробности в сопроводительном документе
2М Гидроксид натрия +2М Глицин			Сделано на месте и подробности в сопроводительном документе
2М Гидроксид натрия +2М Глицин			Сделано на месте и подробности в сопроводительном документе
Cell-star 96 скважина  микропластина	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 лунка  микропластина	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA раствор для усиления	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA раствор для усиления Perkin	Elmer	1244-104
Ice
Лед
Считыватель микропланшетов Infinite 200 PRO NanoQuant	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant	TECAN
Nonbinding (NBS) 96 луночные микропланшеты	Corning	3641
Non-binding (NBS) 96 луночные микропланшеты	Corning	3641
Inlab Routine	Mettler Toledo
pH-электрод Inlab Routine	Mettler Toledo
pH-метр (sevenCompact)	Mettler Toledo
pH-метр (sevenCompact)	Mettler Toledo
Набор для анализа белка Pierce BCA	Thermofisher	23227
Pierce BCA	Thermofisher	23227
Инкубатор для культивирования тканей (37 ° C, 5% CO2)
Тип I коллаген крупного рогатого скота, 3 мг/мл;	Corning	354231
Коллаген для плаценты человека III типа, 0,99 мг/мл	Advanced Biomatrix	5021