Методическая статья

Одношаговая стратегия мечения эндогенных генов у Drosophila melanogaster на основе CRISPR

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64729

⸱

26 января 2024 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем упрощенный протокол эндогенного мечения генов дрозофилы, в котором используется метод на основе ПЦР для безмаркерной идентификации успешных генетических модификаций, способствующий развитию стабильных линий knock-in.

Аннотация

Изучение субклеточной локализации, динамики и регуляции белков в живых клетках претерпело глубокие изменения с появлением методов, позволяющих маркировать эндогенные гены для получения флуоресцентных белков слияния. Эти методы позволяют исследователям визуализировать поведение белков в режиме реального времени, предоставляя ценную информацию об их функциях и взаимодействиях в клеточной среде. Многие современные исследования по мечению генов используют двухступенчатый процесс, в котором видимые маркеры, такие как изменения цвета глаз, используются для идентификации генетически модифицированных организмов на первом этапе, а видимый маркер удаляется на втором этапе. Здесь мы представляем одноэтапный протокол для выполнения точной и быстрой эндогенной мечки генов у Drosophila melanogaster, который позволяет проводить скрининг инженерных линий без видимого маркера глаза, что дает значительное преимущество по сравнению с предыдущими методами. Для скрининга успешных событий генной мечки мы используем метод генотипирования отдельных мух на основе ПЦР, анализируя небольшой сегмент их средней ноги. Мухи, прошедшие отбор, затем используются для получения стабильных запасов. В этой статье мы подробно расскажем о проектировании и создании плазмид для редактирования CRISPR, а также о методах скрининга и подтверждения инженерных линий. В совокупности этот протокол значительно повышает эффективность эндогенного мечения генов у дрозофилы и позволяет изучать клеточные процессы in vivo.

Введение

Флуоресцентные белки стали мощными инструментами для визуализации локализации, динамики и белок-белковых взаимодействий в клетках живых организмов 1,2. Мечение эндогенных генов флуоресцентными белками позволяет в течение длительного времени визуализировать клеточные процессы в реальном времени с субклеточным разрешением. Кроме того, эти эндогенные методы мечения генов имеют ряд преимуществ по сравнению с подходами к гиперэкспрессии и иммуноокрашиванию. Например, чрезмерная экспрессия белков может привести к неправильному сворачиванию белков, неспецифическим белок-белковым взаимодействиям и неправильной локализации3. На сегодняшний день исследователям удалось создать обширные библиотеки эндогенных генов, слитых с флуоресцентными белками для нескольких модельных организмов, таких как почковающиеся дрожжи, которые могут подвергаться эффективной гомологичнойрекомбинации. В случае с Drosophila melanogaster были разработаны различные инструменты, такие как MiMICs5, энхансерные ловушкина основе транспозонов 6 и fosmids7 для флуоресцентного мечения генов.

Разработка инструментов на основе CRISPR-Cas9 позволила эффективно выполнять редактирование генома, в том числе мечение эндогенных белков, в широком диапазоне модельных организмов 8,9. Cas9 представляет собой РНК-управляемый фермент, который расщепляет двухцепочечную ДНК высокоэффективным и специфичнымобразом8, которая затем может быть восстановлена с помощью негомологичного пути присоединения концов (NHEJ), приводящего к точечным мутациям или делециям. В качестве альтернативы, гомологический путь репарации (HDR) позволяет интегрировать гетерологичную ДНК в хромосому.

Прошлые методы мечения генов на основе CRISPR в модельном организме Drosophila melanogaster основывались на двухступенчатом процессе 10,11,12. Для этого используется различимый маркер цвета глаз Dsred для обнаружения успешных событий HDR. После этого маркер Dsred иссекался с помощью системы рекомбинации Cre/loxP. Чтобы упростить и ускорить этот процесс, мы представляем более простой и эффективный метод. Такой подход позволяет избежать необходимости в летальном генотипировании и позволяет проводить прямой скрининг отдельных мух. В частности, мы используем подход, основанный на ПЦР, для извлечения ДНК из небольшого сегмента средней ноги мухи, что позволяет нам генотипировать отдельных мух. Примечательно, что эта процедура не ставит под угрозу жизнеспособность, подвижность или репродуктивные возможности отобранной мухи. Только подходящие особи, выявленные с помощью этого метода, в дальнейшем развиваются в стабильные стаи.

Здесь мы представляем подробный протокол генерации мух, меченных флуоресцентными белками, у которых эндогенные гены помечены флуоресцентными репортерами. Этот метод использует редактирование генома CRISPR-Cas9 для слияния любой желаемой флуорофорной метки с N- или C-концом эндогенного гена. Ниже мы опишем проектирование и конструирование плазмид гРНК и плазмиды-донора, стратегию одноэтапного скрининга для отбора CRISPR-положительных мух и шаги по установлению стабильных линий. В частности, мы описываем стратегии маркировки эндогенных основных часов гена дрозофилы, и точка, с помощью флуорофора на С-конце. Мы также кратко описываем контрольные эксперименты, которые необходимо выполнить, чтобы подтвердить, что меченый белок является функциональным, и методы визуализации в реальном времени для визуализации белка Period в нейронах живых часов в интактном мозге дрозофилы 13. Протокол, описанный здесь, также широко применим для скрининга кандидатов на делеции и вставки определенных фрагментов ДНК путем редактирования генома CRISPR-Cas9.

Протокол

1. Проектирование и конструирование реагентов для редактирования генов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения эндогенного мечения необходимо идентифицировать различные изоформы нужного гена. В зависимости от конкретных целей эксперимента, флуоресцентная метка может быть встроена либо внутри, либо на N- или C-концах выбранной изоформы белка. Для оптимального CRISPR-опосредованного редактирования крайне важно расположить две сгРНК достаточно близко к предполагаемому сайту вбивания. Впоследствии, чтобы обеспечить возможность редактирования посредством гомологичной рекомбинации, необходимо подготовить донорский вектор, включающий последовательности, гомологичные гену-мишени, вместе с флуоресцентной меткой. Ниже приведено пошаговое руководство по этим процессам (рисунок 1).

  1. Спроектируйте сгРНК, как описано ниже.
    1. Спроектируйте sgRNA для дрозофилы , используя эти веб-сайты: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ или http://www.flyrnai.org/crispr2/.
    2. Для веб-сайта flycrispr введите последовательность ±100.н., окружающую желаемое место выбивания (N-терминал, C-терминал или любой интересующий геномный локус). Если в качестве фона для инъекции используется nos-Cas9 attP2, выберите вариант генома Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Система Nos-Cas9 обеспечивает специфичную для зародышевой линии экспрессию Cas9.
    3. Чтобы повысить эффективность экспрессии sgRNA, выбирайте мишени CRISPR с опцией 5' G , так как sgRNA, которые начинаются с гуанина, усиливают активность редактирования. Затем нажмите кнопку Find CRISPR Targets . Отобразится список возможных последовательностей sgRNA.
    4. Для каждой последовательности нажмите кнопку Оценить . Это действие проверяет наличие потенциальных мишеней для каждой последовательности на основе ранее выбранного генома. Из предложенного списка выберите 2 сгРНК с 0 отклонениями от мишеней. Убедитесь, что одна sgRNA находится выше по течению, а другая — вниз по течению относительно места вбивания. В идеале их расположение должно быть как можно ближе к месту выбивания (<200.н.), но они не должны перекрывать друг друга (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может быть трудно найти подходящие sgRNA для данного гена-мишени. Зазор между сгРНК и местом выбивания может быть увеличен до ± 200.н. Использование сгРНК, не инициирующих G, может немного снизить частоту положительных результатов.
  2. Выполните выбор флуоресцентной метки, как описано ниже.
    1. Флуоресцентные метки обладают разнообразными характеристиками, каждая из которых имеет свои уникальные преимущества и недостатки 1,2. При определении идеальной флуоресцентной метки для мечения конкретного белка учитывайте ключевые моменты, описанные в следующих шагах.
    2. Учитывая, что естественные уровни экспрессии белка, как правило, намного ниже, чем те, которые наблюдаются в экспериментахс гиперэкспрессией 1,2, начните с меток, которые являются яркими и фотостабильными и соответствуют экспериментальной установке. Некоторые флуоресцентные метки, в частности, некоторые RFP, такие как tdTomato и DsRed, имеют тенденцию образовывать мультимеры14 и могут приводить к агрегации белков.
    3. Для повышения универсальности прикрепляйте эпитопные метки (например, FLAG или V5) к флуоресцентному маркеру с помощью гибкого линкера, который позволяет проводить биохимические анализы, такие как вестерн-блот или коиммунопреципитация.
  3. Для разработки компоновщика выполните действия, описанные ниже.
    1. Для оптимальной функциональности убедитесь, что эндогенный белок и флуоресцентная метка складываются отдельно в соответствующие функциональные формы. Для этого используют пептид-линкер длиной от 2 до 20 аминокислот. Например, поместите два остатка глицина между последней аминокислотой белка Period и первой аминокислотой флуоресцентного белка mNeonGreen.
    2. Убедитесь, что эти пептидные последовательности линкера содержат аминокислоты, такие как глицин и серин, которые придают гибкость структуре15. Это гарантирует, что естественное поведение и расположение эндогенного белка остаются неизменными.
  4. Спроектируйте вектор-донор, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Донорский вектор вводит флуоресцентную метку в желаемое эндогенная локацию посредством процесса репарации, направленной на гомологию, который инициируется расщеплением CRISPR. Таким образом, помимо флуоресцентной метки, донорский вектор должен обладать гомологичными последовательностями с обеих сторон метки.
    1. Начните разработку донорского вектора с организации последовательности ДНК пептида-линкера и флуоресцентной метки и убедитесь, что гомологичные последовательности расположены по бокам обоих концов (плечи гомологии). Для достижения оптимальных результатов убедитесь, что плечи гомологии охватывают не менее 800 нуклеотидов с каждой стороны предполагаемого места вдавливания (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недавние исследования показывают, что плечи гомологии могут быть короче (100-200.н.)16.
    2. Убедитесь, что все последовательности PAM в донорской плазмиде модифицированы таким образом, чтобы аминокислотная последовательность результирующего белка оставалась неизменной. Если последовательность PAM находится в UTR, удалите ее полностью.
    3. Расположение кодона START и STOP зависит от расположения метки. Для внутреннего мечения убедитесь, что флуоресцентная метка находится в кадре с кодирующей последовательностью целевого гена. Для маркировки N-конца расположите флуоресцентную метку перед эндогенным стартовым кодоном. Для маркировки С-конца расположите флуоресцентную метку перед естественным стоп-кодоном и убедитесь, что сохранен только один начальный кодон, чтобы избежать потенциальных проблем с трансляцией.
  5. Синтезируйте sgRNA и донорские плазмиды, как описано ниже.
    1. Для создания плазмиды sgRNC следуйте рекомендациям по клонированию U6-гРНК, которые можно найти на flycrispr.org/protocols/grna/. Используйте альтернативный подход к клонированию на основе фермента рестрикции (в предоставленном ресурсе он называется стратегией C) для вставки последовательности гРНК в плазмиду pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
    2. Преобразование в DH5a E. coli (NEB, C2987H) в соответствии со стандартными протоколами трансформации, предоставленными производителем. Для верификации проводят секвенирование по Сэнгеру на полученных клонах с использованием праймеров стандартного секвенирования Т3 или Т7.
    3. Для создания донорской плазмиды приобретите двухцепочечную ДНК с желаемой донорской последовательностью у коммерческих поставщиков (например, IDT). Интегрируйте его в сайт множественного клонирования pBlueScriptII SK(-). Секвенирование плазмиды-донора, чтобы убедиться, что последовательности sgRNA или PAM правильно модифицированы и в плазмиде отсутствуют SNP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой интеграции с помощью pBlueScriptII является ПЦР плеч гомологии и сегментов флуоресцентной метки по отдельности и консолидация их в магистраль с помощью таких методов, как сборка Golden Gate или сборка Gibson.
  6. Используйте следующую схему впрыска и скрещивания.
    1. Чтобы получить мух с отредактированной зародышевой линией, необходимо совместно ввести плазмиды гРНК и плазмиду-донора в соответствующий фон Cas9 (например, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Если вы пользуетесь коммерческими услугами по инъекциям, следуйте инструкциям поставщика для выполнения подготовки плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, концентрация плазмиды гРНК должна превышать 0,5 мкг/мкл, а концентрация плазмиды донора должна быть выше 1,0 мкг/мкл. Обычно от отправки образцов плазмид до получения введенных эмбрионов проходит примерно 2 недели. Здесь представлена стратегия скрининга событий редактирования генов в Х-хромосоме с использованием балансирного штамма FM7/L. Для генов на второй или третьей хромосоме используйте соответствующие штаммы-балансиры.
    2. Для сбора инъекционных мух (G0) обезболивают углекислым газом и отделяют самцов мух и девственных самок. Установите скрещивание мух, соединив каждого самца G0 по крайней мере с двумя девственными самками FM7/L в отдельных узких пищевых флаконах CT. Поместите скрещенные флаконы в вентилируемый инкубатор при температуре 25°C и влажности ~60% до тех пор, пока F1 не приблизится (FM7/L является наиболее часто используемым балансиром Х-хромосомы). Точно так же соедините каждую самку G0 с самцами FM7/Y.
    3. Обезболить и собрать не менее 10 девственных потомков женского пола (F1) от скрещивания самцов и самок G0. От скрещивания самок G0 соберите не менее 10 самцов мух F1 (рис. 3A). Убедитесь, что каждая муха F1 помечена сведениями о ее происхождении и хранится отдельно. Переходите к этапу скрининга.
  7. Используйте следующий протокол ПЦР для одной ноги.
    1. Создание праймера: Разработайте пару праймеров, охватывающих сайт редактирования целевого гена. В идеале температура плавления грунтовок должна быть одинаковой, около 55°C.
    2. Приготовление лизисного буфера: Приготовьте 10 мкл лизисного буфера для каждого образца мухи. Буфер состоит из 10 мМ Tris (рН 8,2), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 25 мМ NaCl и 400 мкг/мл протеиназы K. Приготовьте буфер для лизиса в виде мастер-смеси, затем распределите по 10 мкл в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Убедитесь, что буфер остается холодным на протяжении всего процесса рассечения ноги (Рисунок 3B).
    3. Настройка трубки: Подготовьте стеклянные капиллярные пробирки, заполнив один конец сахарозно-агаровой пищей (2% агара и 4% сахарозы), и поместите их в глубоколуночную тарелку на 96 лунок, которая будет называться «мухо-отель» (рис. 3C).
    4. Рассечение ноги: Поместите угарную анестезиологическую подушку под стереомикроскоп, обезболивайте одну муху-кандидата и отрежьте одну из средних ног. Поместите ножку в лизисный буфер, обеспечив полное погружение. Мацерировать ногу не нужно, сразу приступайте к этапу протокола лизиса (рисунок 3Б). Удерживайте крыло мухи тонкими металлическими щипцами, переместите муху в гостиницу для мух и немедленно запечатайте трубку пряжей.
    5. Контрольные образцы: Две мухи дикого типа могут быть использованы в качестве негативного контроля после одной и той же процедуры рассечения ноги. В качестве положительного контроля выступает разбавленная донорская плазмида.
    6. Уход после вскрытия: Поместите муху в вентилируемый инкубатор при температуре 25 °C и влажности ~60%. Хотя мухи могут выжить в течение ночи, рекомендуется завершить последующие этапы и спаривание в течение того же дня.
    7. Протокол лизиса: Поместите отрубленные ноги в буферный раствор лизиса в амплификатор с температурой 37 °C в течение 90 минут, затем 95 °C в течение 5 минут, наконец, при температуре 4 °C. Это позволит извлечь достаточное количество ДНК из одной ноги каждой мухи (рис. 3B).
    8. ПЦР-реакция: Организуйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, используя 1,5 мкл лизата муховых лапок в качестве источника ДНК.
    9. Гель-электрофорез: Подвергнуть ПЦР-продукты электрофорезу в агарозном геле. Интерпретируйте результаты геля в зависимости от размера браслета. Как правило, мухи с отрицательным контролем демонстрируют более низкую полосу, а положительные контрольные плазмиды - более высокую полосу. Убедитесь, что конкретные размеры браслетов соответствуют исходной конструкции донорской плазмиды. Самки положительных мух будут иметь две полосы, так как они гетерозиготны, а самцы будут иметь одну полосу (рис. 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, скрининг 70 мух достижим за один день. Убедитесь, что идентифицировано не менее 10 положительных мух F1 в результате 4-5 различных скрещиваний G0, так как некоторые F1 могут быть стерильными из-за мутаций, не попадающих в цель.
  8. Выполните следующую перекрестную подготовку после ПЦР.
    1. Основываясь на результатах геля, выберите положительных мух из мухового отеля и индивидуально скрестите их с мухами-балансирами (FM7/L для мечения генов Х-хромосомы) для получения поколения F2. Как только появится поколение F2, установите скрещивание братьев и сестер для создания гомозиготных стабильных подвоев (рис. 3D).
    2. Используйте гомозиготные подвои для секвенирования по Сэнгеру сайта редактирования, чтобы обеспечить точность. Обратное скрещивание проверенных линий мух с мухами дикого типа для удаления фоновых мутаций. Скрининг каждого поколения с использованием протокола ПЦР с одной ногой.

Результаты

В наших экспериментах мы обычно находили ~20%-30% успеха в скрининге различных эндогенных меченых генов на всех хромосомах (X, II, III). Эффективность этого процесса может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, таких как отбор гРНК, природа гена и качество инъекции. Здесь мы проиллюстрируем результаты нашей стратегии по маркировке гена эндогенного периода флуорофором mNeonGreen13. Ген менструации , расположенный на Х-хромосоме D. melanogaster, играет ключевую роль в циркадных часах. Дрозофила имеет хорошо охарактеризованную часовую сеть, состоящую примерно из 150 часовых нейронов, которые экспрессируют часовые белки17.

Мы пометили белок Period зеленым флуоресцентным белком mNeonGreen на его С-концевом конце, соединенным двойным глициновым линкером13. После инъекции плазмиды мы скрестили мух G0 с балансиром FM7/L и впоследствии собрали поколение F1. Из 126 мух F1, прошедших скрининг с использованием специализированных праймеров для ПЦР (табл. 1), мы выявили 47 положительных случаев, что дало 37,3% успеха. Из них мы отобрали 5 особей F1 для создания дополнительных скрещиваний для получения стабильных запасов. Пол не влиял на частоту положительных результатов во время этого скрининга. После проверки точности последовательности меченого гена мы провели контрольные тесты, включая поведенческую оценку и оценку кПЦР, чтобы обеспечить осцилляции мРНК для подтверждения функциональности меченого белка (PERIOD-mNeonGreen)13.

Чтобы провести эксперименты по получению изображений в реальном времени, мы скрестили этих мух PERIOD-mNeonGreen с Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdТоматная муха, где Clock856-GAL4 мечет все часовые нейроны19 , а CD4 является трансмембранным белком, который мечет клеточные мембраны. Для экспериментов с визуализацией в реальном времени мы препарировали мозг 3-4 взрослых людей, используя ледяную среду дрозофилы Шнайдера. Мозг был смонтирован и сфотографирован с помощью конфокального микроскопа Airyscan. На рисунке 4 показаны репрезентативные изображения, отображающие белок PERIOD в часовых нейронах мозга дрозофилы .

Блок-схема клонирования sgRNA и донорской плазмиды с подробным описанием инъекции эмбриона CRISPR и генетического скрининга.
Рисунок 1: Схема протокола редактирования генов на основе CRISPR/Cas9. Протокол описывает ряд этапов по проектированию и сборке сгРНК и донорских плазмид с последующим скринингом методом одноэтапной ПЦР и получением стабильных инженерных линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма редактирования генов CRISPR-Cas9; показывает sgRNA, Cas9, репарацию ДНК, гомологически направленную репарацию.
Рисунок 2: Схема редактирования генома CRISPR/Cas9 для создания мух с периодическим mNeonGreen . (A) Схема, иллюстрирующая добавление флуоресцентной белковой метки к С-концу эндогенного гена. (B) Ген эндогенного периода (per) помечен mNeonGreen, ярким мономерным зеленым флуоресцентным белком на карбоксильном конце. Две sgRNA находятся в последнем экзоне и 3'UTR соответственно. Вектор-донор содержит две последовательности гомологий размером ~1 кб, фланкирующие тег mNeonGreen. Стоп-кодон добавляется в конец тега для правильного завершения перевода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Процесс скрининга мух: генетические скрещивания и метод ПЦР, диаграмма, экстракция геномной ДНК, электрофорез.
Рисунок 3: Стратегия скрининга CRISPR-положительных мух. (A) Подход к организации предварительного скрининга генетических скрещиваний для генов, предназначенных для мечения CRISPR на X и II хромосомах. G0 обозначает первоначально введенных мух, в то время как F1 представляет их потомство первого поколения, которое требует скрининга. (B) Описан метод скрининга методом ПЦР на одной ноге и продолжительность каждого этапа процедуры. (C) Здесь показана фотография отеля Fly. Стеклянные трубки заполняются кормом от мух и запечатываются с одного конца. Одиночные мушки загружаются в отдельные трубки. После того, как ДНК, извлеченная из среднего светодиода отдельных мух, исследуется, соответствующие мухи берутся из гостиницы и устанавливаются стабильные линии. (D) Подход к организации постскрининговых скрещиваний мух (показан здесь синим цветом), которые прошли скрининговый тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Изображение флуоресцентной микроскопии клеток; ZT0-ZT2; локализация белков; Сравнение клеточных процессов.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения белка PERIOD-mNeonGreen в часовых нейронах. Репрезентативные изображения мух период-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato , увлекаемых циклами Свет-Тьма. ZT относится к Zeitgeber Time, ZT0 относится ко времени включения света, а ZT12 относится ко времени выключения света. Ядерная оболочка часового нейрона помечена tdTomato, показанной здесь красным цветом, а белок PERIOD помечен mNeonGreen и показан зеленым цветом. Белок PERIOD организован в дискретные ядерные очаги в течение поздней ночи и раннего утра. Масштабные линейки, 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

ИмяПоследовательность ДНК (от 5' до 3')
Периодический скрининговый праймер впередATACTCGTCCATAGACCACG
Периодическая трафаревка обратного ходаACATTATCCTCGGCTTGCAT
на гРНК1-смыслcttcACCAGACACAGCACGGGGAT
пер-гРНК1-антисмыслaaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT
на гРНК2-смыслcttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG
пер-гРНК2-антисмыслaaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC
Гомология периода и вставка mNeonGreenGAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA
GGGCGACCTGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA
CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC
TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC
AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat
gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcaaaccttctcgtagTGGCCACT
TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGACAACAAGGC
GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCGAACCGAGTGCTGAACCAGGAGT
GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC
AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT
ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCTCTACGACGAGTT
CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT
CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA
CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCTCGATTAA
AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT
TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA
AACCTTAGGGCTGAGAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC
CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT
AGGATAGATATCATTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT
КТАКАТТАКТАКТККТГГКТТГКЭТГГГГГГТТГГГГГГГГГГКЭТККТГГГГГКЭТКТТ
CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTACTTGTTCGGA
TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGGTTGAT
TCGAAGAActtgaagggaatggaagggggagttaggaataggaactggtgg
gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTTTCCA
GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTGCTCGGATCATC
CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTTACGTCGGT
CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTTACTTGTACAGTTCGT
CCATACCCATGACATGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT
TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCTTTTT
TTCGAAAGACATCGGTTGGTTTTGTAGTAGT
CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTGTTCGCGCT
GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTGTGTATAGGAC
КАТТТГААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААААА
GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC
GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG
TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATGGCTACCT
TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC
CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC
GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC
CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG
ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT
CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC
GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTCCGACCATATC
GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG
CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC
TTCACCCTTCGACACACCTCCCGCCGTCGCCGTCGCCGTGCT
GTGTCTGGTCCTCCCGGGTGCTCCATCTTCTTGC
TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaagaatggatta
cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG
ТГКТГГГГТТТТТТТТТГГГГГГГГГГГГГГГГАКТКТК
CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA
AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA
TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc
ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT
GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTCG
GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGAATGGGCGA
GGAGTCCGGCACCTCTCTTGCAGGGATCGGATA
CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA
TGCGCTCTGCGAGGAGGGACGCTGCACCTGGGC
AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC
TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta
tggagttggagttggagttaagagttcggtgaggcaccggccccactg
acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTTACGCGGATTGGG
AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG
GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT
GGCCGTGGGGGGGCCGCCGCCGGGGGGTGTGTGTGTTAG
AAAAGCGAAGGATGGGGTACATCACGCCGGCCAT
GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGGGGGCCGCCGCA
GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGTGC
CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG
CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGCGGGGGA
ТГТАГААГГТГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГА
GAAGCTGCTCTGGGCCATGGCCGTGTGTGTGCGTGGAG
ТГАААКГГГГГГГГГГГГГАТГКККАКГГАГГГТГ
GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA

Таблица 1: Список последовательностей sgRNA для мечения гена эндогенного периода на С-конце и праймеров, используемых для проведения скрининга ПЦР с одной ногой.

Обсуждение

Результаты демонстрируют оптимизированную, простую одношаговую стратегию мечения эндогенных генов дрозофилы, основанную на CRISPR. В протоколе мы используем две гРНК для более эффективного индуцирования двухцепочечного разрыва ДНК и гомологичной рекомбинации. РНК и донорская плазмида вводятся в эмбрионы плодовых мушек, которые экспрессируют фермент Cas9 в своей зародышевой линии. Эти эмбрионы впоследствии культивируются в стандартных условиях до взрослого возраста, после чего их скрещивают с мухами-балансирами, чтобы произвести потомство первого поколения (F1). ПЦР-генотипирование проводится на средней ноге каждого образца F1 для скрининга генетически модифицированных мух. Этот метод дает значительное преимущество по сравнению с существующими методами скрининга, которые используют два этапа скрининга, где первый шаг основан на использовании видимого маркера, такого как цвет глаз, для определения соответствующего генотипа, а второй этап включает удаление маркера цвета глаз10. Здесь мы представляем метод, использующий ПЦР на ДНК, выделенной из небольшого сегмента средней ноги отдельной мухи, позволяющий проводить нелетальное генотипирование отдельных мух, предлагая более эффективную и экономичную альтернативу существующим методам. Этот метод позволяет проводить скрининг животных-кандидатов по одному или партиями до тех пор, пока не будет выделен соответствующий генотип. Количество животных, прошедших скрининг перед выделением соответствующих стад, варьируется от эксперимента к эксперименту в зависимости от многих факторов, включая эффективность выбранных sgRNA, эффективность инъекций, нецелевые введения, которые могут повлиять на жизнеспособность. В качестве альтернативы ДНК из отдельных крыльев отдельных мух также может быть использована для целей генотипирования18.

Возможно, добавление метки к N- или C-концу гена может отрицательно повлиять на функцию гена, что потенциально может повлиять на жизнеспособность мух. Если информация о структуре белка доступна, она может быть использована для определения того, может ли N- или С-концевая маркировка лучше сохранять функцию и локализацию нативного белка. Всегда рекомендуется проводить контрольные эксперименты, в том числе проверять, демонстрирует ли меченый белок ту же картину локализации, что и белок дикого типа, методами окрашивания антителами. Та же стратегия скрининга может быть использована для скрининга других видов генетических вставок или делеций на основе CRISPR. В заключение следует отметить, что одноэтапная стратегия скрининга значительно упрощает создание мух, отредактированных методом CRISPR, и открывает множество возможностей для изучения субклеточной локализации и динамики эндогенных генов в их нативном контексте.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джорджа Ватасе и Джози Клоуни за дискуссии на начальных этапах разработки протокола. Работа была поддержана средствами NIH (грант No R35GM133737 для S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (для S.Y.) и McKnight Scholar Award (для S.Y.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5M ЭДТА pH8.0ИнвитрогенAM9260G
5-альфа Компетентный E. coli ( Высокая эффективность)NEBC2987H
96-луночная глубоколуночная пластинаBRAND701354
AgarFisher ScientificBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
Соляная кислотаFisher ScientificA142-212
Пролонгированное стекло Антивыцветающая монтажная средаInvitrogenP36982
Протеиназа KQIAGEN19131
Schneider's Drosophila MediumGibco21720001
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-500
T4 DNA ligaseNEBM0202S
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
XbaINEBR0145S

Ссылки

  1. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
  2. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  3. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  4. Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
  5. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  6. Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  7. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068(2016).
  8. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
  9. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  10. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  11. Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539(2019).
  12. Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
  13. Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).
  14. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077(2022).
  17. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
  18. Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
  19. Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPRsgRNA

Похожие статьи