Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64742

⸱

5 мая 2023 г.

 ,  , 
1Department of Basic Medicine, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение легочных интерстициальных макрофагов (ИМ) и их адоптивный перенос после стимуляции IL-33 альвеол легких на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза (IPF) in vivo .

Аннотация

Воспалительная реакция, вызванная ранним повреждением легких, является одной из важных причин развития идиопатического легочного фиброза (ИЛФ), который сопровождается активацией воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, а также высвобождением воспалительных факторов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. Известно, что раннее воспаление, вызванное активированными легочными интерстициальными макрофагами (ИМ) в ответ на стимуляцию IL-33, играет жизненно важную роль в патологическом процессе IPF. Этот протокол описывает адоптивный перенос IM, стимулированных IL-33, в легкие мышей для изучения развития IPF. Он включает в себя выделение и культивирование первичных IM из легких мыши-хозяина с последующим приемным переносом стимулированных IM в альвеолы мышей-реципиентов IPF, индуцированных блеомицином (BLM) (которые ранее были истощены альвеолярными макрофагами путем лечения клодронатными липосомами) и патологическую оценку этих мышей. Репрезентативные результаты показывают, что адоптивный перенос макрофагов, стимулированных IL-33, усугубляет легочный фиброз у мышей, что позволяет предположить, что проведение эксперимента по адоптивному переносу макрофагов является хорошим техническим средством для изучения патологии IPF.

Введение

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) - это диффузное воспалительное заболевание легких, вызванное многими факторами1. В цитокиновом микроокружении иммунного ответа Th1 и Th2 макрофаги могут быть поляризованы на классически активированные макрофаги (M1) и альтернативно активированные макрофаги (M2). Липополисахариды (ЛПС) или цитокин ИФН-γ индуцируют макрофаги М1 поляризоваться и продуцировать провоспалительные цитокины, включая iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α и IL-12. Напротив, цитокины II типа IL-4 и IL-13 управляют поляризацией макрофагов M2, которые могут продуцировать различные факторы, стимулирующие рост фибробластов, такие как TGF-β и PDGF, которые способствуют легочному фиброзу2. Патологический процесс ИЛФ сопровождается активацией и инфильтрацией макрофагов. IPF опосредует восстановление травмы, воспаление и фиброз за счет высвобождения цитокинов3. Поскольку доступны лишь ограниченные терапевтические возможности, изучение молекулярных патологических механизмов ИЛФ имеет большое значение для разработки новых стратегий профилактики и лечения ИЛФ. Предыдущие исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями 4,5, подтвердили повышенное высвобождение IL-33 у пациентов с IPF и на мышиных моделях с блеомицином (BLM)-индуцированным IPF. IL-33 высвобождается эпителиальными и эндотелиальными клетками во время фиброза и участвует в активации макрофагов, что приводит к аномальной пролиферации фибробластов, инфильтрации лейкоцитов и, в конечном итоге, к потере функции легких5. Текущий протокол описывает адоптивный перенос IL-33-стимулированных интерстициальных макрофагов (IM) в альвеолы в качестве средства изучения развития IPF на мышиных моделях. Здесь IM выделяли из легочной ткани мышей-хозяев, культивировали in vitro, стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а затем адоптивно переносили в альвеолы мышей-реципиентов путем инъекции в трахею. Было обнаружено, что прямой сбор стимулированных макрофагов мыши и их адаптационный перенос в альвеолы реципиента усугубляет степень легочного фиброза и может более наглядно проиллюстрировать влияние стимулирующих факторов на фиброз по сравнению с предыдущими исследованиями6. Метод, описанный в этой статье, может позволить исследователям изучить функцию макрофагов, стимулируемых потенциальными цитокинами, в развитии IPF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментального благополучия животных Университета Цзяннань (JN No 20211,130m1720615[501]).

ПРИМЕЧАНИЕ: Всего в этом исследовании было использовано 10 мышей-самцов C57BL/6 в возрасте 6-8 недель и весом 20-25 г. Три экспериментальные группы в исследовании включали по три мыши-реципиента каждая, и одна мышь-хозяин использовалась для выделения IM.

1. Истощение легочных макрофагов мыши

  1. Достаньте флакон с клодронатными липосомами (см. Таблицу материалов) из холодильника за 30 мин, подогрейте его до комнатной температуры и несколько раз перевернуте, чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клодронатные липосомы инкапсулируют гидрофильные молекулы дихлорметиленбисфосфоната. Когда эти липосомы потребляются макрофагами, клодронат постепенно высвобождается под действием лизосомной фосфатазы, и, следовательно, его накопление вызывает апоптоз клеток и истощение макрофагов7.
  2. Обезболивают мышей 3% изофлураном. Проверьте глубину анестезии, ущипнув одну ногу, чтобы проверить сознание. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Аспирируют 60 мкл клодронатных липосом с помощью пипетки со стерильным всасывающим наконечником. Вводят лекарство по каплям в носовую полость анестезированной мыши, так что при вдыхании мыши лекарство вдыхается в трахею. После каждой капли убедитесь, что мышь полностью вдыхает препарат и дышит ровно. Вводят липосомы, содержащие только PBS, в качестве контроля8 (рис. 2).
  4. Поместите мышей на стол с постоянной температурой 38 ° C для повторного нагрева, чтобы ускорить их выздоровление. Следите за мышами, пока они не проснутся. После того, как мыши хорошо восстановятся и достигнут лежачего положения грудины, переведите их в клетку.
  5. Используйте мышей с истощенными альвеолярными макрофагами через 2 дня после лечения клодронатными липосомами в качестве мышей-реципиентов для эксперимента по переносу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании истощение альвеолярных макрофагов было подтверждено проверкой экспрессии маркеров макрофагов, как описано ранее 8,9, после ингаляционного введения клодронатных липосом (см. Дополнительный рисунок 1).

2. Изоляция и культура ИМ

  1. Обезболивайте мышь-хозяина внутрибрюшинной инъекцией кетамина (120 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг). Подтвердите глубину анестезии с помощью потери рефлекса защемления пальцев ног. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Затем продезинфицируйте кожу анестезированной мыши 75% спиртом и йодом. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и обнажить сердечно-легочную ткань
  2. Аспирируйте 10 мл 1x PBS в шприц с иглой 20 G и вставьте кончик иглы в правое предсердие мыши (рис. 3A). Разрежьте нижнюю полую вену мыши хирургическими ножницами, а затем вручную перфузируйте мышь PBS с постоянной скоростью (10-20 мл / мин), пока легочная ткань не побелеет. Иссеките легочную ткань и перенесите ее в ледяной PBS в чашке для культивирования (рис. 3B).
  3. Разрежьте легочную ткань на фрагменты размером примерно 2 мм х 2 мм х 2 мм. Затем добавьте 15 мл модифицированной среды Дульбекко Игла (DMEM), содержащей 1% коллагеназы А, в легочную ткань, чтобы изолировать макрофаги. Инкубировать при 100 об/мин в течение 30 мин на встряхивающем столе при температуре 37 °C.
  4. Аспирируйте суспензию легочной ткани через шприц объемом 10 мл не менее 20 раз, чтобы сделать ее как можно более тонкой. Отфильтруйте эту суспензию через сетчатое фильтр для клеток размером 40 мкм. Центрифугируйте фильтрат при 400 x g в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Лизируют эритроциты в гранулах, добавляя 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) на льду в течение 2-3 мин.
  6. После центрифугирования в дозе 150 x g в течение 5 мин ресуспендируют клеточную гранулу 10 мл DMEM (содержащего 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  7. Засейте клетки в 10-сантиметровые чашки для клеточных культур в количестве 2 x 107 клеток на чашку и инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C и 5% CO2. Это позволяет легким IM прилипать к тарелке5. Через 1 ч аспирируют надосадочную и плавающую клетки и добавляют 10 мл свежей полной питательной среды (ДМЭМ, содержащей 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Инкубация более 8 ч или ночь.
  8. Определите чистоту полученных ИМ с помощью проточной цитометрии с окрашиванием на маркеры F4/80 и CD11c, как описано ранее5 (см. дополнительный рисунок 1).

3. Адоптивный перенос ИМ в альвеолы легких

  1. Замените питательную среду из пластины, содержащей изолированные легочные ИМ (этап 2.7), на полную питательную среду, содержащую 10 нг/мл IL-33 для стимуляции ИМ. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2. Используйте 1x PBS вместо Ил-33 в качестве контроля.
  2. Диссоциируйте легочные IM, обрабатывая их 1 мл 0,25% трипсина в течение 5 минут. Затем утолите пищеварение, добавив 3 мл свежей культуры, и соберите легочные макрофаги, центрифугируя клеточную суспензию при 150 x g и 4 ° C в течение 5 минут. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте клетки в PBS до конечной концентрации 5 x 105 клеток / 50 мкл.
  3. Анестезируйте мышей-реципиентов 3% газом изофлураном. Дождитесь, пока мышь потеряет сознание (как в шаге 1.2), а затем зафиксируйте конечности анестезированной мыши на вертикальной пластине с помощью медицинской ленты. Аккуратно потяните язык мыши в сторону с помощью ватного тампона.
  4. Включите лампу интубации и посветите ею на горло мыши так, чтобы была видна трахея. Убедитесь, что трахея находится близко к основанию языка, пищевод находится возле задней части шеи, но отверстие пищевода не видно во время операции.
  5. Используйте лампу для интубации мыши (22 G). Направьте внутреннюю игольчатую канюлю в трахею с помощью направляющей проволоки (диаметр 0,4 мм). Снимите направляющий провод и вставьте канюлю в трахею мыши, чтобы завершить интубацию.
  6. После того, как канюля войдет в трахею, введите 50 мкл клеточной суспензии (содержащей 5 x 105 IM) мыше-реципиенту через трахею.
  7. Поместите мышей на постоянную грелку при температуре 38 ° C для повторного разогрева, чтобы ускорить восстановление. Следите за мышами, пока они не проснутся. После того, как они хорошо восстановятся и достигнут лежачего положения на грудине, переведите их в клетку.
  8. Через 24 часа вводят блеомицин (BLM) через трахею (используя процедуру, описанную на этапах 3.3-3.5) в дозе 1,4 ЕД/кг массы тела, чтобы вызвать ИЛФ. Введите равный объем физиологического раствора контрольной группе.
  9. Через 21 день определите степень тяжести легочного фиброза для различных групп мышей, которые были адоптивно перенесены с PBS или суспензией IM, стимулированной IL-33, путем оценки экспрессии маркеров фиброза и баллов Эшкрофта10.
    1. Извлеките общую РНК из легочной ткани с помощью реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количественный анализ проводился с помощью считывателя микропланшетов. Если соотношение OD260/OD280 составляет 1,8-2,0, чистота РНК высокая. Все образцы хранились при температуре −80 °С.
    2. Проведите флуоресцентную количественную ПЦР для оценки экспрессии α-гладкомышечного актина (СМА) и фибронектина с использованием специальных праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры, используемые для α-SMA, были прямым 5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACG-3' и обратным 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', а праймеры, используемые для фибронектина, были прямым 5'-TCTGGGAAATGGAAAGGGGAATGG-3' и обратным 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
  10. Выполните иммуногистохимию, как описано ниже.
    1. Обезвоживайте левое легкое, встраивайте его и нарезайте парафиновым слайсером до толщины 4 мкм.
    2. Поместите срезы ткани на предметные стекла и запекайте их в духовке при температуре 65-70 ° C в течение от 30 мин до 1 ч. Удаляйте воски с предметных стекол с уменьшающимся процентом спирта (т.е. 100%, 95%, 90%, 80% и 70% спирта) в течение 5 минут.
    3. Окрашивают предметные стекла в растворе гематоксилинового красителя (аналитически чистом) в течение 5 мин. Затем промойте предметные стекла водопроводной водой. Замочите предметные стекла в 1% спирте соляной кислоты на 3 с, смойте плавающий цвет и замочите в проточной воде на 5 мин. Секции станут синими.
    4. Погрузить в раствор эозина на 10 с - 1 мин (время окрашивания определяют по цвету), промыть водопроводной водой и поместить в 70%, 80%, 95%, 100% и 100% спирт соответственно на 5 мин каждый. Затем поместите предметные стекла в растворы ксилола I и ксилола II на 3 мин. После высыхания наблюдайте и делайте фотографии под вертикальным микроскопом с нейтральной клейкой герметизирующей пленкой.
    5. Выполните оценку Эшкрофта на срезах, чтобы указать тяжесть легочного фиброза10. Проведите статистический анализ данных с использованием t-критерия двух независимых выборок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используемый здесь протокол кратко изложен на блок-схеме на рисунке 1. Вдыхание клодронатных липосом через нос (рис. 2) использовалось для истощения легочных макрофагов взрослых мышей C57BL / 6, и это дало хорошую модель мыши-реципиента. Легочные IM были выделены от другой необработанной мыши (хозяина) мыши (рис. 3A, B) и культивированы in vitro. Выделенные макрофаги стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование предоставляет эффективный метод истощения, изоляции, культивирования и переноса макрофагов, который может помочь в изучении механизмов легочного фиброза у мышей. Существует множество методов истощения макрофагов мыши, таких как введение в трахею, инъекция в хвостовую вену и ингаляцияв нос 11. В этом исследовании оптимизирован метод назальной ингаляции, который прост в эксплуатации и может эффективно истощать легочные макрофаги 8,9

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы признают специальную тему управления лабораторией Цзяннаньского университета: создание библиотеки цифровых срезов на основе патологических образцов (JDSYS202223) и Национального фонда естественных наук Китая (81800065).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  DMEMLife technologies Biotechnology,США1508012
Артериальная игла для постоянного проживанияB Braun Melsingen AG,Германия21G15G8393
BD  Accuri  C6 PlusBecton Dickinson,США
BleomycinBiotang, СШАAb9465
Инкубатор углекислого газаThermo Forma, СШАThermo Forma370
CD11bR& D Systems, США1124F
CD11cR& D Systems,СШАN418
Чашка для клеточных культурThermo Forma, США174926
Клодронатные липосомы Клодронатные липосомы, НидерландыCI-150-150
коллагеназа ASigma-Aldrich, США10103578001
F4/80R& D Systems,США521204
Falcon Cell StrainerBecton, Dickinson and Company, США352340
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life technologies,США1047571
гематоксилин Эозин Нанкин Цзяньчэн Технолоджи, Китай06-570
ЛайтЦиклер 480 ПЦР система обнаруженияRoche, США
мышиный рекомбинантный фактор ИЛ-33Пепротех, США210-33
Никон микроскопНикон Корпорейшн, Япония941185
Пенициллин, стрептомицинЛайф технологии,США877113
фосфат буфер (PBS)Guangdong Huankai Microbial Technology, Китай1535882
RBC лизис буферBeyotime Biotechnology Company, КитайC3702
Изолятор РНКVazyme company, КитайR401-01-AAРеагент для экстракции общей РНК
RWD Ингаляционный наркозный аппаратШэньчжэнь Rayward Life Technology, КитайR500
Полуавтоматический парафин слайсерLeica, ГерманияLeicaRM2245
SYBR Premix Ex TaqTakara, Япония410800
Трипсин 0.25%Life Technologies, США1627172

Ссылки

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897(2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846(2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
  11. Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.

Step 2.1 of the Protocol was updated from:

Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

to:

Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

Теги

IL 33
Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.