Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышь in vivo Плацентарная манипуляция CRISPR

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64760

⸱

14 апреля 2023 г.

 ,  , 
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем специфический по времени метод эффективного манипулирования критическими путями развития плаценты мыши in vivo. Это выполняется путем инъекции и электропорации плазмид CRISPR в плаценты беременных маток на эмбриональный день 12,5.

Аннотация

Плацента является важным органом, который регулирует и поддерживает развитие млекопитающих в утробе матери. Плацента отвечает за передачу питательных веществ и отходов между матерью и плодом, а также за выработку и доставку факторов роста и гормонов. Плацентарные генетические манипуляции у мышей имеют решающее значение для понимания специфической роли плаценты во внутриутробном развитии. Плацентарно-специфические трансгенные мыши, экспрессирующие Cre, имеют различную эффективность, и другие методы манипулирования плацентарными генами могут быть полезными альтернативами. В этой статье описывается метод прямого изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций с генами CRISPR, который может быть использован для модификации экспрессии целевых генов. Используя относительно продвинутый хирургический подход, беременные матери подвергаются лапаротомии на эмбриональный день 12,5 (E12,5), и плазмида CRISPR доставляется стеклянной микропипеткой в отдельные плаценты. Плазмида сразу же подвергается электропорации после каждой инъекции. После восстановления матери плаценты и эмбрионы могут продолжать развитие до оценки в более поздний момент времени. Оценка состояния плаценты и потомства после использования этого метода может определить роль специфической во времени функции плаценты в развитии. Этот тип манипуляции позволит лучше понять, как генетика и функция плаценты влияют на рост и развитие плода в контексте множественных заболеваний.

Введение

Плацента является важным органом, участвующим в развитии плода. Основная роль плаценты заключается в обеспечении необходимых факторов и регулировании передачи питательных веществ и отходов плоду и от него. Плаценты млекопитающих состоят как из плодной, так и из материнской ткани, которые составляют интерфейс плода и матери, и, таким образом, генетика как матери, так и плода влияет на функцию1. Генетические аномалии или нарушение функции плаценты могут резко изменить развитие плода. Предыдущая работа показала, что генетика и развитие плаценты связаны с измененным развитием определенных систем органов у плода. В частности, аномалии в плаценте связаны с изменениями в мозге, сердце и сосудистой системе плода 2,3,4,5.

Транспорт гормонов, факторов роста и других молекул от плаценты к плоду играет важную роль в развитии плода6. Было показано, что изменение плацентарной продукции определенных молекул может изменить развитие нервной системы. Воспаление матери может увеличить выработку серотонина за счет изменения экспрессии метаболического гена триптофана (TRP) в плаценте, что впоследствии создает накопление серотонина в мозге плода7. Другие исследования обнаружили аномалии плаценты наряду с пороками сердца. Считается, что аномалии в плаценте способствуют врожденным порокам сердца, наиболее распространенному врожденному дефекту у людей8. Недавнее исследование выявило несколько генов, которые имеют сходные клеточные пути как в плаценте, так и в сердце. Если эти пути нарушены, они могут вызвать дефекты в обоих органах9. Дефекты плаценты могут усугубить врожденные пороки сердца. Роль генетики и функции плаценты в развитии специфической системы органов плода является новой областью исследований.

У мышей есть гемохориальная плацента и другие особенности плаценты человека, что делает их очень полезными моделями для изучения заболеваний человека1. Несмотря на важность плаценты, в настоящее время отсутствуют целенаправленные генетические манипуляции in vivo. Кроме того, в настоящее время существует больше вариантов нокаутов или нокдаунов, чем манипуляции с чрезмерной экспрессией или усилением функции в плаценте10. Существует несколько трансгенных линий, экспрессирующих Cre, для плацентарно-специфических манипуляций, каждая из которых находится в разных линиях трофобласта в разные моменты времени. К ним относятся Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER и Gcm1-Cre11,12,13,14. Хотя эти трансгены Cre эффективны, они могут быть не способны манипулировать некоторыми генами в определенные моменты времени. Другим широко используемым методом нокаута или сверхэкспрессии экспрессии плацентарных генов является встраивание лентивирусных векторов в культуру бластоцисты, что вызывает специфическую для трофобласта генетическую манипуляцию15,16. Этот метод позволяет добиться устойчивого изменения экспрессии плацентарных генов на ранних стадиях развития. Использование РНК-интерференции in vivo редко используется в плаценте. Вставка плазмид шРНК может быть выполнена аналогично методу CRIPSR, описанному в этой статье. Это было сделано на E13.5 для успешного снижения экспрессии PlGF в плаценте, что влияет на сосудистую сеть мозгапотомства 17.

В дополнение к методам, которые в основном используются для нокаута или нокдауна, индуцирование сверхэкспрессии обычно выполняется с помощью аденовирусов или введения экзогенного белка. Методы, используемые для сверхэкспрессии, имеют разную степень успеха и в основном выполняются на более поздних сроках беременности. Для изучения роли инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) в функции плаценты был проведен аденовирально-опосредованный перенос плацентарного гена для индуцирования сверхэкспрессии гена IGF-1 18,19. Это было выполнено на поздних сроках беременности мыши на E18.5 с помощью прямой плацентарной инъекции. Чтобы предоставить дополнительные возможности и обойти возможные неудачи установленных плацентарных генетических манипуляций, таких как сбои комбинации Cre-Lox, возможная токсичность аденовирусов и нецелевые эффекты шРНК, можно использовать прямые манипуляции CRISPR с плацентой in vivo 20,21,22. Эта модель была разработана для решения проблемы отсутствия моделей сверхэкспрессии и создания модели с гибкостью.

Этот метод основан на работе Lecuyer et al., в которой плазмиды shRNA и CRISPR были нацелены непосредственно in vivo на плаценты мыши для изменения экспрессии PlGF 17. Этот метод может быть использован для непосредственного изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций CRISPR в несколько моментов времени; для этой работы был выбран Е12.5. Плацента к этому моменту созрела и достаточно велика, чтобы ею можно было манипулировать, что позволяет вставлять специфическую плазмиду CRISPR на E12.5, что может оказать значительное влияние на развитие плода от середины до конца беременности23,24. В отличие от трансгенных подходов, но подобно вирусной индукции или РНК-интерференции, этот метод допускает сверхэкспрессию или нокаут в определенные моменты времени с использованием относительно продвинутого хирургического подхода, что позволяет избежать возможного нарушения плацентации или эмбриональной летальности из-за более ранних изменений. Поскольку только несколько плацент получают экспериментальную или контрольную плазмиду в помете, подход допускает два типа внутреннего контроля. Этими контрольными элементами являются те, которые вводят и электропорируют соответствующую контрольную плазмиду, и те, которые не подвергаются прямым манипуляциям. Этот метод был оптимизирован для создания сверхэкспрессии гена IGF-1 в плаценте мыши с помощью плазмиды CRISPR синергетического медиатора активации (SAM). Был выбран ген IGF-1, так как IGF-1 является важным гормоном роста, доставляемым плоду, который в основном вырабатывается в плаценте до рождения25,26. Этот новый метод CRISPR, нацеленный на плаценту, позволит проводить прямые манипуляции, чтобы помочь определить связь между функцией плаценты и развитием плода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с федеральными правилами и политикой Университета Айовы и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Животные и животноводство

  1. Держите животных в 12-часовом световом дневном цикле с едой и водой ad libitum.
  2. Используйте CD-1 самок мышей в возрасте 8-15 недель. Используйте наличие копулятивной пробки для идентификации Е0,5.
  3. На Е0,5 поодиночке размещают беременные плотины.

2. Калибровка микропипетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка микропипетки должна быть выполнена перед операцией, когда это возможно.

  1. Перед изготовлением и калибровкой микропипетки разбавьте все плазмиды до рекомендуемой концентрации (0,1 мкг/мкл) в воде, не содержащей ДНКазы. Смешайте плазмиду с соответствующим образом разбавленным красителем Fast Green (1 мкг/мкл в PBS) (конечная концентрация плазмиды: 0,06 мкг/мкл).
  2. Вытягивайте микропипетки с помощью стеклянных капилляров диаметром 10 см с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм с помощью съемника микропипеток.
  3. Аккуратно отломите кончик микропипетки (2-3 мм) стерильными щипцами.
  4. Загрузите микропипетку в микрокапиллярный наконечник, прикрепленный к микроинжектору. Убедитесь, что микроинжектор подключен к машине для микроинъекций и что уровень азота достаточен для калибровки микропипетки.
  5. После того, как микропипетка прикреплена к микроинжектору, загрузите в нее раствор красителя Fast Green для выполнения калибровки (1 мкг/мкл в PBS). Откалибруйте микропипетку для введения объема примерно 3,5 мкл. Опорожните («очистите») микропипетку, готовясь к загрузке плазмидных растворов, как показано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая микропипетка будет немного отличаться. Чтобы избежать повреждения плаценты во время инъекции, время инъекции следует установить в пределах 0,5-1,5 с. Давление должно быть установлено в пределах 1-8,5 фунтов на квадратный дюйм. Откалибруйте каждую микропипетку отдельно; Если микропипетка не может быть откалибрована в рамках этих параметров, то ее не следует использовать.

3. Хирургия (рис. 1А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки очистите поверхности как подготовительной, так и хирургической областей 70% этанолом. Поместите впитывающую подкладку в зону подготовки. В области хирургии положите грелку вниз, а затем положите поверх нее впитывающую подкладку. Стерилизуйте все инструменты перед операцией. Время нахождения плотины под наркозом должно составлять менее 1 часа.

  1. Обезболивание
    1. Введите 5 мг / кг НПВП (мелоксикама) или другого одобренного анальгетика беременной женщине за 30 минут до 1 часа до операции.
    2. Поместите беременную мать в индукционную камеру, прикрепленную к испарителю изофлурана.
    3. Установите испаритель на 4% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода.
    4. После того, как анестезия будет подтверждена отсутствием реакции на защемление пальца ноги и снижением частоты дыхания, удалите плотину из индукционной камеры в область подготовки.
  2. Подготовка к операции
    1. В зоне подготовки поместите плотину на спину с носовым конусом.
    2. Уменьшите содержание испарителя до 2% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода, пока плотина находится в носовом обтекателе.
    3. Тщательно побрейте брюшко плотины и удалите лишнюю шерсть. Поочередно покрывайте бритый живот раствором повидона и 70% этанола три раза, используя стерильные аппликаторы с ватными наконечниками. Нанесите последний слой раствора повидона. Чтобы предотвратить высыхание роговицы, нанесите искусственный слезный гель на оба глаза плотины (рис. 2A, B).
    4. После подготовки переместите плотину с носовым конусом в назначенную операционную зону.
  3. Лапаротомия матки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные перчатки на протяжении всей хирургической процедуры. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. В области хирургии поместите лежачий лежа на спине и закрепите носовой конус на месте с помощью ленты. Установите грелку под впитывающей прокладкой на 45 °C.
    2. С помощью щипцов и ножниц сделайте разрез кожи примерно на 2 см по средней линии. Используйте щипцы, чтобы наложить палатку на кожу, и сделайте вертикальный разрез на коже. После этого сделайте еще один разрез аналогичного размера через брюшину, чтобы обнажить рога матки. Используя щипцы, заткните брюшину, делая вертикальный разрез (рис. 2C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неспособность правильно наложить палатку при разрезе брюшины может привести к смертельному разрезу кишечника.
    3. Аккуратно помассируйте рога матки через разрез, надавливая по бокам живота. Делайте это, осторожно направляя матку без инструментов, используя только пальцы, чтобы избежать случайной травмы. Поместите обнаженную матку поверх стерильной хирургической простыни, закрывающей брюшную полость матери, и держите ее влажной на протяжении всей операции с помощью капель стерильного физиологического раствора, который можно нагреть до 30 ° C перед использованием по мере необходимости (рис. 2E, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рога матки могут быть идентифицированы, как описано в Wang et al.27.
    4. После того, как матка обнажена, выберите три пары плацент для манипуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плаценты могут быть идентифицированы, как описано Elmore et al.24. Для максимальной приживаемости эмбрионов следует обрабатывать не более 6 плацент. Если присутствует менее 12 эмбрионов, следует вводить не более 4 плацент. Выберите две соседние плаценты так, чтобы одна получила контрольную инъекцию, а другая — экспериментальную плазмиду. Использование двух соседних плацент позволяет лучше сравнивать плаценты в аналогичных местах матки, а также обеспечивает повышенную выживаемость. Выбранные плацентарные пары выбираются случайным образом и располагаются по обоим рогам матки (рис. 1B).
    5. Запишите расположение плацентарных манипуляций и организацию эмбрионов в рогах матки, чтобы эмбрионы и плаценты можно было идентифицировать во время сбора, так как одна мать будет нести как контрольные, так и экспериментально обработанные плаценты/эмбрионы.
  4. Плацентарная инъекция и электропорация контрольной плазмиды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания асептической техники перед использованием стерилизуйте электропорационные лопасти и микроинжектор холодным стерилизующим средством. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. Используя калиброванную микропипетку, загрузите достаточное количество соответствующей контрольной плазмиды для трех инъекций. Выполните все инъекции на глубине ~0,5 мм латерально в плаценту между децидуа (белая) и соединительной зоной (темно-красная) (рис. 3A-F).
    2. Выполняют инъекции в три контрольные плаценты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все контрольные инъекции плазмиды перед экспериментальными инъекциями, чтобы избежать перекрестного загрязнения плазмид микропипеткой. Это позволит использовать одну и ту же микропипетку, так как смена микропипеток и время калибровки резко увеличивают время операции и снижают выживаемость матери.
    3. Проведите электропорацию контрольной плазмиды плаценты в течение 2 мин после инъекции.
    4. Для электропорации используйте пару лопастей диаметром 3 мм, прикрепленных к электропорационной машине. Чтобы обеспечить эффективность включения CRISPR и жизнеспособность эмбрионов, используйте следующие настройки электропорации: 2 импульса, 30 В, импульс 30 мс, импульс 970 мс выключен, униполярный.
    5. После инъекции, но непосредственно перед электропорацией, покройте места контакта стерильным физиологическим раствором, нанося физиологический раствор точно на три участка на стенке матки и лопатки с помощью капельницы или шприца.
    6. Аккуратно надавите на лопатки электропорации на боковых сторонах плаценты. Поместите лопасть анода над местом впрыска и катодом прямо напротив (рис. 4A-C).
    7. Нажмите на импульс на электропорационной машине и дождитесь завершения двух импульсов, прежде чем снимать электропорационные лепестки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество белой пены часто наблюдается между лопатками и плацентой во время импульсов. Если этого не произошло, перед дальнейшим использованием проверьте напряжение на лопастях вольтметром. Если показания вольтметра не совпадают с настройкой напряжения электропорации, лопасти не работают.
  5. Плацентарная инъекция и электропорация экспериментальной плазмиды
    1. Следуйте тем же инструкциям, что и на шаге 3.4.1. к этапу 3.4.2. использование экспериментальной плазмиды вместо контрольной плазмиды.
    2. Проведите электропорацию всех трех экспериментальных инъецированных плацент в течение 2 минут после инъекции. Это следует выполнять так же, как и для тех, кому вводят контрольные плазмиды. Выполните шаг 3.4.4. к этапу 3.4.7.
  6. Завершение операции
    1. После завершения манипуляций с плацентой аккуратно помассируйте рога матки обратно внутрь брюшной полости, используя только пальцы (рис. 5А).
    2. Во-первых, выполните двойные одиночные швы на брюшинном слое, используя рассасывающиеся швы с покрытием и плетеными рассасывающимися швами длиной 45 см игольчатым сплавом 13 мм 3/8c. Разместите швы на расстоянии 2-3 мм друг от друга (рис. 5B).
    3. После наложения швов на слой брюшины наложите швы на кожу рассасывающимися швами. Тройной узел одинарных швов на расстоянии 2-3 мм друг от друга, чтобы гарантировать, что плотина не сможет расстегнуть шов (рис. 5C).
    4. После завершения наложения швов установите изофлуран на 1%, а кислород на 3,5 л / мин и нанесите тканевый клей на швы на коже (рис. 5D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевый клей не является обязательным, но рекомендуется для предотвращения повторного открытия разреза из-за жевания плотины.
    5. Когда тканевый клей высохнет, выключите испаритель и удалите плотину из области операции. Поместите плотину в поддерживающую клетку на спине.

4. Послеоперационный уход и наблюдение

  1. Дайте беременной матери восстановиться в чистой клетке под наблюдением в течение как минимум 30 минут, чтобы избежать немедленных осложнений операции. Наблюдайте до тех пор, пока он не станет полностью амбулаторным и не сможет перевернуться на ноги без посторонней помощи. Одиночный дом плотины после операции.
  2. Следите за послеоперационным уходом и наблюдением в учреждении до сбора эмбрионов. Записывайте вес плотины и ежедневно контролируйте швы и место разреза.

5. Сбор плаценты E14.5

  1. На E14.5 глубоко обезболите плотину коктейлем кетамин/ксилазин (1 мг/мл кетамина и 0,1 мг/мл ксилазина), а затем цервикально вывихните плотину.
  2. Сделайте ножницами V-образный надрез в брюшной полости плотины, а матку извлеките. Сразу же выложите на 5-сантиметровую чашку Петри со льдом. С помощью щипцов аккуратно извлеките эмбрион и соответствующую плаценту из матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите учет расположения эмбриона и соответствующей плаценты в рогах матки, чтобы определить, какая из них подверглась непосредственной манипуляции во время операции.
  3. Запишите вес плаценты. Используя щипцы и бритвы без РНК, разрежьте плаценту пополам по средней линии. Положите одну половину в 4% PFA при 4 ° C. Разрежьте оставшуюся половину пополам и храните оставшиеся две четверти при температуре -80 ° C в двух пробирках, одна из которых содержит реагент для хранения РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы и другие материнские ткани можно хранить из коллекции при температуре -80 °C для использования в будущем.

6. Анализ экспрессии плацентарных генов

  1. Используйте четверть плаценты, хранящуюся при -80 ° C в реагенте для хранения РНК.
  2. Обработайте плаценты для кПЦР, как описано в Elser et al., используя метод Trizol для выделения РНК, спектрофотометр для определения концентрации РНК, набор для синтеза кДНК и кПЦР с помощью SYBR Green Master Mix28. Вместо набора ДНК Turbo DNAfree, упомянутого в Elser et al., используйте набор RNAcleanup после выделения РНК Trizol, чтобы убедиться, что образцы не содержат загрязняющих веществ28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прочтите паспорт безопасности материала (MSDS) для тризола и используйте его в химическом вытяжном шкафу.
  3. Оцените плазмидную вставку контрольной плазмиды с праймерами GFP и экспериментальной плазмиды с праймерами BLAST (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте значение КТ, чтобы определить наличие плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения КТ выше 35 являются ложноположительными, и только те, которые ниже 35, следует считать положительным показателем того, что плазмида была успешно вставлена.
  4. Оцените экспрессию плаценты IGF-1 , нормализованную к гену 18 домашнего хозяйства (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте метод ddCT для расчета изменения сгиба, а затем рассчитайте нормализованное изменение сгиба экспериментальных образцов на среднее изменение сгиба контрольных образцов.

7. Анализ уровня плацентарного белка

  1. Используйте четверть плаценты, которая хранилась при -80 ° C. Гомогенизируют ткань в буферном растворе, состоящем из 11,5 мМ Tris HCl, 5 мМMgCl2 и 10 мМ ингибитора протеазы в diH2O с конечным рН 7,4. Используйте ручной гомогенизатор и пестик, чтобы разбить ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец не должен превышать 10% от объема буфера.
  2. Разбавьте гомогенизированные образцы в буфере в соотношении 1:12 так, чтобы они находились в пределах обнаруживаемого диапазона набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA). Выполните анализ BCA в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите общий белок с помощью планшетного считывателя.
  3. После проведения анализа BCA нормализуйте все образцы до одинаковой концентрации общего белка 2 мг / мл для ИФА IGF-1, как это было сделано в Gumusoglu et al.29.
  4. Выполните ИФА ИФР-1 в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите уровни белка ИФР-1 с помощью считывателя планшетов, используя стандартную кривую концентрации.

8. Пространственная верификация CRIPSR с использованием флуоресцентной гибридизационной маркировки in situ

  1. После того, как половинки плаценты будут надлежащим образом зафиксированы в 4% PFA при 4 ° C в течение 1-3 дней, переместите их в 20% сахарозу при 4 ° C, прежде чем заморозить их в смеси с оптимальной температурой резки (OCT).
  2. Последовательно разделите плаценту, встроенную в ОКТ, в криостате -20 °C на срезы по 10 мкм и поместите их на предметные стекла для маркировки. Разделите плаценту пополам так, чтобы были видны все три субрегиона. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования для гибридизации in situ .
  3. Выполняйте маркировку флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в соответствии с протоколами производителя. Гибридизуйте один слайд с зондом dCas9-3xNLS-VP64 и второй «сестринский» слайд той же плаценты с зондом Prl8a8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд dCas9-3xNLS-VP64 обнаруживает присутствие плазмиды сверхэкспрессии. Зонд Prl8a8 выделяет спонгиотрофобласты соединительной зоны, что позволяет идентифицировать субрегионы плаценты. Эти два зонда помечены на отдельных «сестринских» предметных стеклах, чтобы избежать интерференции многоканальной флуоресценции с зеленой автофлуоресценцией в плацентах.
  4. Пометьте оба зонда детектирующим красителем (Opal 620). После выполнения протокола производителя для FISH нанесите монтажную среду DAPI и поместите покровное стекло на предметное стекло. Запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей.
  5. Изобразите слайды на вертикальном составном флуоресцентном микроскопе и обработайте их с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений. Здесь использовалось программное обеспечение CellSens.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общие результаты процедуры (рис. 6)
В исследовании было три манипулируемые группы. К ним относятся плаценты, которым вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 (Cas9 Control), контрольную плазмиду CRISPR активации (Act Control) или активационную плазмиду IGF-1 SAM (Igf1-OE). Cas9 Control лучше подходит для нокаутирующих плазмид, а контроль активации лучше подходит для плазмид с гиперэкспрессией/активацией. Для оценки изменений жизнеспособност...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Плацента является основным регулятором роста плода, и, как отмечалось ранее, изменения в экспрессии или функции плацентарных генов могут существенно повлиять на развитие плода6. Протокол, изложенный здесь, может быть использован для выполнения целенаправленных манипуляций in vivo CRISPR с плацентой мыши с использованием относительно продвинутого хирургического подхода. Этот метод позволяет получить значительный выход жизнеспособных эмбрионов и соответствующих им плацент, которые могут быт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Авторы признают следующие источники финансирования: R01 MH122435, NIH T32GM008629 и NIH T32GM145441. Авторы благодарят лаборатории доктора Вэла Шеффилда и доктора Кельвина Картера в Университете Айовы за использование их операционной комнаты и оборудования, а также доктора Эрика Ван Оттерлоо, доктора Нандакумара Нараянана и доктора Мэтью Вебера за их помощь в микроскопии. Авторы также благодарят доктора Сару Маурер, Майю Эванс и Шрилеху Кунду за их помощь в проведении пилотных операций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробиркиСША Scientific Inc1615-5500
4% параформельгида (PFA) в PBSThermo Fisher ScientificJ61899.
96 Well PlateCornings3598Для набора BCA
Абсорбирующие пеленкиFisher Scientific14-206-62
Контроль активации ПлазмидаSanta Cruz Biotechnologysc-437275Вода без дназы предусмотрена для разбавления
AMV Обратная транскриптазаNew England BiolabsM0277LИспользование для синтеза кДНК
Анестетик Газовый вапорайзерVetamacVAD-601TTVAD-компактный вапорайзер
Искусственный слезоточивый гельAkornNDC 59399-162-35
Набор для анализа белка BCAThermo Fisher Scientific23227Количественная оценка белка
БиовортексерBellco Glass, Inc.198050000Ручной гомогенизатор тканей
Программное обеспечение CellSensOlympusV4.1.1Обработка изображений в FISH-изображения.
Центрифуга 5810EppendorfEP022628168Планшетная центрифуга
ХлороформThermo Fisher ScientificJ67241-APВыделение РНК
Аппликаторы с ватными наконечникамиProAdvantage77100Стерилизовать перед использованием
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Вода без Dnase, предназначенная для разбавления
CryoStatLeicaCM1950
Диссекционный микроскопLeicaM125 CИспользуется для визуализации после некроскопии
: Растворимые швы,Med Vet InternationalJ385H
, Дистиллированная водаGibco15230162
Дульбекко, фосфатно-солевой буфер (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144(-) Кальций; (-) Магний
ECM 830 Электропоратор (Электропоратор)BTX Гарвардский аппарат45-0662Генератор только
Электрическая бритваWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation весла/TweezertrodesBTX Гарвардский аппарат45-0487Весла диаметром 3 мм; провода в комплекте Встраиваемая
кассета: 250 PKGrainger21RK94Кассеты для встраивания плаценты
Этанол Thermo Fisher Scientific268280010
F-Air канистрыPenn Veterinary Supply IncBIC80120Избыток изофлурана
фильтр Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GРастворить до 1 мкм; г/мл и фильтр; защита от света
Микропланшетный фотометр на основе фильтра (планшетный ридер)Fisher Scientific14377576Может использоваться для щипцов BCA и ELISA
VWR82027-386Тонкие наконечники, прямые, зубчатый
раствор формалина, нейтральный буферный, 10%Sigma AldrichHT501128
стеклянные капилляры - боросиликатное стекло (микропипетка)ИнструментСаттераB150-86-10Наружный диаметр: 1,5 мм, Внутренний диаметр: 0,86 мм, длина 10 см
Коктейль из протеазы и ингибитора фосфотазы Halt (100x)Thermo Scientific1861281гомогенизации белка
ThermotechS766DЦифровая влажная грелка
ГемостатикVWR10806-188Полностью сюррированная челюсть; изогнутая
Ванна с горячей водойFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTВода без дназы для разбавления
Индукционная камераVetamac941443Не требуется определенный размер литра
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Изопропональный/2-пропональныйFisher ScientificA451-4Выделение РНК
Кетамин HCl 100мг/млAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Магнейсум хлоридSigma Aldrich63069-100ML1M. Гомогенизация белка MicroAmp
™ Оптический 384-луночный реакционный планшет со штрих-кодомFisher Scientific4309849Пластины со штрих-кодом не требуются
Микрокапиллярный наконечникEppendorf5196082001Прикреплен к микроинъектору BTX Микроинъектор
BTX Harvard Apparatus45-0766Держатель для пипеток из нержавеющей стали, длина 130 мм, для пипеток от 1 до 1,5 мм
Microject 1000A (инжекционный аппарат)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus
Система Съемник микропипеток Модель P-97Инструмент СаттераP-97Пылающий/коричневый тип Микропипетка
Микшер для микропластин (Встряхиватель пластин)scilogex822000049999
мыши/крысы IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
ИглыBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0,3 мм x 13 мм)
Азотный бакLinde7727-37-9Любой внутренний газ
Нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Аналесгические средства, такие как Мелоксикам
Конус для носаVetamac9216099-14 мм
Опал 620 красительдля обнаружения Akoya BiosciencesSKU FP1495001KTиспользуется для FISH
Оптимальная температура резки (O.C.T) СоединениеСакура4583
Кислородный баллонLinde7782 - 44 - 7Кислородные
пестикиСША Scientific Inc14155390
раствор повидона-йода, 5%Avrio Health L.P.НДЦ 67618-155-16
Энергетика СИБР&трейд; Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Использование для qPCR
Random Hexamers (случайные праймеры)New England BiolabsS1330SИспользование для синтеза кДНК
Бритвенное лезвиеGrainger26X080
Набор для очистки РНК и КонцентраторZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Содержит все реагенты, необходимые для флуоресцентной гибридизации in situ. Щупы продаются отдельно.
РНКоскоп и торговля; Probe- mm-Prl8a8-C2Расширенная клеточная диагностика  528641-C2
РНКоскоп и торговля; Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Расширенная диагностика клеток527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Сухая печь для гибридизации in situ
НожницыVWR82027-578Препарирующие ножницы, острый наконечник, 4¹/?
Хлорид натрия (физиологический раствор)HospraNDC 0409-4888-03стерильный,  0,9%
цитрат натрия, тринатриевая соль, дигидрат, [лимонная кислота, дигидрат тринатрия]Research Product International03-04-6132
Концентрат гидроксида натрия 1N, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Буфер для гомогенизации белка
ПароваркаBellaB00DPX8UBA
Стерильная хирургическая простыняBusse696Стерилизовать перед использованием
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
ШприцыBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Шприц стерильный, одноразового использования, 1 мл
Thermo Scientific & торговля; Invitrogen™ Nanodrop™ Один спектрофотометр с WiFi и Qubit™ 4 ФлуориметрFisher Scientific13-400-525Эта конфигурация поставляется с флуориметром Qubit 4. Количественная оценка кубитов не требуется.
Тканевый клей3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Буфер для гомогенизации белка
TRIzol™ РеагентThermo Fisher Scientific15596018выделение РНК
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Используется для разбавления красителя для обнаружения Opal 620
Универсальный F-контурVetamac40200Прикреплен к вапорайзеру и аксессуарам для испарителя
Вертикальный составной флуоресцентный микроскопOlympusBX61VSИспользуется для визуализации FISH
Vectorshield с DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip монтажный носитель
ViiA™ 7 Система для ПЦР в реальном времени с 384-луночным блокомThermo Fisher Scientific4453536Это для обнаружения 384-луночных блоков SYBR. TaqMan и/или меньшие блоки доступны
Wet n Wild Лак для ногтей Wild Shine, прозрачный протектор для ногтей, цвет для ногтейAmazonC450B
Ксилазин 20 мг/млAnased343730_RX
AP Буферная грелка для медицинского класса

Ссылки

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPRin vivoIGF 1
Мышь in vivo Плацентарная манипуляция CRISPR
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.