Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Миелинизация периферических аксонов in vitro в кокультуре ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков крыс и шванновских клеток

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64768

⸱

10 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Ruhr-University Bochum, St. Josef Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В системе кокультуры ганглиев дорсальных корешков и шванновских клеток можно изучать миелинизацию периферической нервной системы. Эта модель предоставляет экспериментальные возможности для наблюдения и количественной оценки периферической миелинизации и изучения влияния интересующих соединений на миелиновую оболочку.

Аннотация

Процесс миелинизации необходим для обеспечения быстрой и достаточной передачи сигнала в нервной системе. В периферической нервной системе нейроны и шванновские клетки участвуют в сложном взаимодействии, чтобы контролировать миелинизацию аксонов. Нарушения этого взаимодействия и разрушение миелиновой оболочки являются признаками воспалительных невропатий и возникают вторично при нейродегенеративных расстройствах. Здесь мы представляем модель кокультуры ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков и шванновских клеток, которая развивает надежную миелинизацию периферических аксонов для исследования процесса миелинизации в периферической нервной системе, изучения взаимодействия аксон-шванновских клеток и оценки потенциального воздействия терапевтических агентов на каждый тип клеток в отдельности. Методологически ганглии дорсальных корешков эмбриональных крыс (E13.5) собирали, диссоциировали от окружающих их тканей и культивировали как целые эксплантаты в течение 3 дней. Шванновские клетки были выделены от 3-недельных взрослых крыс, а седалищные нервы были ферментативно переварены. Полученные шванновские клетки очищали магнитно-активированной сортировкой клеток и культивировали в условиях, обогащенных нейрегулином и форсколином. После 3 дней культивирования ганглиозной эксплантата дорсального корешка 30 000 шванновских клеток добавляли к одному ганглиозному эксплантату дорсального корня в среде, содержащей аскорбиновую кислоту. Первые признаки миелинизации были обнаружены на 10-й день кокультуры через рассеянные сигналы к основному белку миелина при иммуноцитохимическом окрашивании. Начиная с 14-го дня, миелиновые оболочки формировались и размножались вдоль аксонов. Миелинизация может быть количественно определена окрашиванием основного белка миелина как отношение площади миелинизации и площади аксонов, чтобы учесть различия в плотности аксонов. Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов периферической миелинизации in vitro, что имеет решающее значение для понимания патологии и возможных возможностей лечения демиелинизации и нейродегенерации при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы.

Введение

В периферической нервной системе (ПНС) быстрая информационная трансдукция опосредована аксонами, обернутыми миелином. Миелинизация аксонов необходима для обеспечения быстрого распространения электрических импульсов, поскольку скорость проводимости нервных волокон коррелирует с диаметром аксона и толщиной миелина1. Сенсорная передача сигналов от периферии к центральной нервной системе (ЦНС) основана на активации сенсорных нейронов первого порядка, которые находятся в расширениях дорсального корешка, называемых ганглиями дорсальных корешков (DRG). Для образования и поддержания миелина необходима непрерывная связь между аксонами и шванновскими клетками, которые являются миелинизирующими глиальными клетками в ПНС.2.

Многие заболевания ПНС нарушают трансдукцию информации либо первичным аксональным, либо демиелинизирующим повреждением, что приводит к гипестезии или дизестезии. Сенсорные нейроны первого порядка обладают способностью к регенерации до некоторой степени после повреждения нейронов путем сложного взаимодействия между нейроном и окружающими шванновскими клетками3. В этом случае шванновские клетки могут подвергаться клеточному перепрограммированию, чтобы очистить аксональный и миелиновый мусор и способствовать регенерации аксонов, что приводит к ремиелинизации4. Понимание механизмов миелинизации в здоровье и заболевании важно для того, чтобы найти возможные варианты лечения демиелинизирующих расстройств ПНС. Миелин также может быть поврежден острой нейротравмой, и в настоящее время исследуются подходы, способствующие миелинизации для ускорения функционального восстановления после повреждения периферических нервов5.

Наши знания о периферической миелинизации в значительной степени выиграли от миелинизирующих кокультур шванновских клеток и сенсорных нейронов. С тех пор, как были применены первые подходы 6,7,8, миелинизация интенсивно изучалась с использованием различных систем кокультур9,10,11. Здесь мы предлагаем быстрый и простой протокол для надежной миелинизации in vitro аксонов ганглиев дорсальных корешков. Протокол подготовки шванновских клеток основан на протоколе Andersen et al.12, ранее опубликованном в Pitarokoili et al.13. Мы используем шванновские клетки, полученные от молодых крыс, и эмбриональные культуры эксплантатов DRG для совместной культуры, в которой миелинизация происходит примерно на 14-й день. Целью метода является создание системы для исследования образования миелина в результате прямого взаимодействия аксон-шванновских клеток, а также изучение модуляторов миелинизации ПНС. По сравнению с диссоциированными культурами нейрональных клеток, эксплантаты DRG более анатомически сохранены и образуют длинные аксональные отростки. Количественная оценка площади миелинизированного аксона обеспечивает достаточное считывание миелинизации в кокультуре. Этот метод является ценным инструментом для скрининга терапевтических соединений на предмет их потенциального влияния на миелинизацию ПНС, а также может быть использован в дополнение к исследованиям in vivo на животных моделях14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Шванновская клеточная культура

  1. Покрытие для шванновской клеточной культуры
    1. Покройте чашки для клеточных культур в стерильных условиях. Нанесите 2 мл 0,01% поли-L-лизина (ФАПЧ) на две чашки для культивирования тканей (ТС) диаметром 60 мм каждая и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
    2. Удалите ФАПЧ, вымойте посуду TC 2 раза дистиллированной водой и инкубируйте с 2 мл 1 мкг/см2 ламинина в течение ночи при температуре 4 °C. Вымойте посуду TC 2 раза аквадестом и дайте тарелкам высохнуть на воздухе.
  2. Подготовка среды для культивирования шванновских клеток
    1. Приготовьте 50 мл шванновской клеточной среды, добавив 10% инактивированную теплом эмбриональную телячью сыворотку (FCS), 2 мкМ форсколина, 10 нМ нейрегулина и 50 мкг/мл гентамицина к модифицированной среде орла Дульбекко (DMEM)/F-12 (с высоким содержанием глюкозы) в стерильных условиях.
    2. Приготовьте 70 мл среды L-15 Лейбовица с 50 мкг/мл гентамицина в стерильных условиях.
  3. Подготовка седалищного нерва
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы подготовки седалищного нерва выполняются под чистой скамьей.
    1. Приготовьте одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяного фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS) без Ca 2+ и Mg2+, одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяной среды L-15 Лейбовица и одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяной среды L-15 Лейбовица и 50 мкг/мл гентамицина.
    2. Очистите все инструменты автоклавированием. Опрыскайте инструменты и рабочую зону 70% этанолом.
    3. Усыпить пятерых 3-недельных крыс-самцов Sprague Dawley с помощью ингаляции и обезглавливания CO2 . Опрыскайте туловище крысы 70% этанолом.
    4. Вскройте ножницами спинную нижнюю левую конечность и осторожно удалите двуглавую мышцу бедра. Ослабьте седалищный нерв путем плавного возвышения с помощью изогнутых щипцов, чтобы не ушибнуть нерв.
    5. Удерживайте самую проксимальную часть нерва изогнутыми щипцами, чтобы выпрямить нерв, и обрежьте нерв как можно выше с помощью ножниц. Затем подрежьте ножницами нерв близко к крестцовому сплетению и лапе. Повторите шаги 1.3.4-1.3.5 для правой стороны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Открывая конечность, следите за тем, чтобы не повредить кровеносные сосуды.
    6. С помощью щипцов поместите левый и правый седалищные нервы в 100-миллиметровую чашку TC с ледяным DPBS.
  4. Восстановление седалищного нерва
    1. Используйте щипцы для переноса всех нервов в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица и гентамицином 50 мкг/мл. Продолжайте использовать стереомикроскоп и удалите жир, мышцы и кровеносные сосуды из нервов с помощью двух пар тонких щипцов. Захватите нервы щипцами и перенесите их в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица.
    2. Определите проксимальный и дистальный окончания седалищного нерва. Удалите эпиневрий одной парой тонких щипцов в проксимальном и дистальном направлении, удерживая проксимальный нервный конец второй парой тонких щипцов.
    3. Перенесите очищенные нервы в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица и гентамицином 50 мкг/мл. Дразните изолированные нервные пучки, чтобы разделить и изолировать отдельные нервные волокна с помощью двух пар тонких щипцов.
    4. Перенесите нервные волокна в пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и возьмите как можно меньше среды. Добавьте 50 мл среды L-15 Лейбовица с 50 мкг/мл гентамицина к нервным волокнам и несколько раз проведите в трубке объемом 50 мл.
  5. Ферментативное переваривание седалищного нерва
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы (этапы 1.5-1.8, 2.1 и 2.2) выполняются в стерильных условиях.
    1. Приготовьте ферментативный раствор для сбраживания, содержащий 0,25% диспазы II, 0,05% коллагеназы I типа и 50 мкг/мл гентамицина в 10 мл DMEM (с высоким содержанием глюкозы).
    2. Центрифугируйте пробирку при 188 x g в течение 5 мин при 4 ° C, удалите надосадочную жидкость серологической пипеткой объемом 25 мл и перенесите гранулу с оставшейся средой L-15 Лейбовица в чашку TC диаметром 60 мм с помощью пипетки объемом 1000 мл.
    3. Промойте пробирку объемом 50 мл 10 мл раствора ферментативного пищеварения и добавьте ее в посуду, содержащую нервные волокна. Аккуратно распределите ткань в посуде кончиком пипетки, чтобы максимально использовать доступную поверхность для пищеварения.
    4. Инкубировать при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 18 часов и остановить разложение, добавив 10 мл 40% FCS в сбалансированный солевой раствор Хэнкса без Ca 2 и Mg2 + (HBSS).
  6. Разделение клеток
    1. Перенесите переваренные нервы в пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки и центрифуги при 188 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл DMEM, содержащего 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. Затем ресуспендируйте гранулу 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 10 мл, 5 мл, 2 мл, 1 мл и 200 мкл.
    2. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр и центрифугу 100 мкм при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу с 4 мл DMEM, содержащим 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина.
    3. Добавьте 2 мл клеточной суспензии в каждую из двух 60-миллиметровых чашек TC, покрытых ФАПЧ и ламинином, и инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2. Оставьте пластины нетронутыми на 2 дня в инкубаторе, чтобы защитить клетки от механического воздействия и поддержать прилипание.
  7. Дифференцировка шванновских клеток
    1. Через 2 дня удалите среду и тщательно промойте пластины 2 раза с DMEM (высоким содержанием глюкозы), 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. После этого добавьте 2 мл шванновской клеточной среды. Заменяйте шванновскую клеточную среду каждые2-й день и наблюдайте за внешним видом и слиянием клеток с помощью микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шванновские клетки и эксплантаты DRG должны быть подготовлены своевременно и скоординированно для совместной культуры. Убедитесь, что крыса с эмбрионами при E 13,5 доступна для подготовки DRG, когда шванновские клетки близки к слиянию 80%.
  8. Трипсинизация клеток и магнитная сепарация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстративные изображения различных стадий культивирования шванновских клеток см. на дополнительном рисунке 1.
    1. Когда клетки достигнут слияния около 80% (6-12 дней культивирования), тщательно вымойте пластины 2 раза с 3 мл DPBS и инкубируйте с 2 мл 0,05% трипсина / ЭДТА (предварительно подогретого до 37 ° C) в течение 3 минут. Когда клетки отделяются от дна пластины, инактивируют пищеварение добавлением 2 мл DMEM с 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Придерживайтесь времени трипсинизации строго 3 минуты и быстро продолжайте после этого.
    2. Ресуспендируют клеточную гранулу в 2 мл магнитного буфера для разделения клеток, содержащего DPBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 нМ ЭДТА. Соедините 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и подсчитайте клетки с помощью камеры окрашивания.
    3. Центрифугируют суспензию ячейки при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C и ресуспендируют гранулу ячейки в 90 мкл магнитного буфера для разделения ячеек на 1 x 107 ячеек. Добавьте 10 мкл микрогранул Thy-1 на 1 x 107 клеток. Суспендировать раствор несколько раз и инкубировать в течение 15 мин в темноте при 8 °C.
    4. Добавьте 2 мл магнитного буфера для разделения ячеек в суспензию ячейки и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера для разделения магнитных элементов.
    5. Увлажните колонку для разделения магнитных ячеек 1 мл буфера для разделения магнитных ячеек. Поместите колонну разделения магнитных ячеек в сепаратор магнитных ячеек. Приложите ячейки к магнитной сепарационной колонке. Соберите поток и центрифугу при 300 x g при 4 ° C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты положительно отбираются и остаются в колонке, в то время как шванновские клетки проходят через колонку. Фибробласты могут быть собраны с помощью штампа (например, в качестве отрицательного контроля для протоколов окрашивания шванновских клеток).
    6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды для совместной культуры (см. этап 3.1.1). Посчитайте клетки после окрашивания трипановым синим и камеру окрашивания.

2. Культура эксплантата DRG

  1. Подготовка питательной среды DRG
    1. Приготовьте питательную среду DRG, добавив в нейробазальную среду 2% B27, 2% лошадиной сыворотки, 1% L-глютамина, 0,5% пенициллина/стрептомицина и 10 нг/мл фактора роста нервов (NGF). Храните питательную среду при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательную среду можно использовать в течение 2 дней.
  2. Покрытие для эксплантатов DRG
    1. Инкубируют покровные стекла в 70% этаноле в течение 1 ч и помещают в лунки 4-луночной посуды с помощью изогнутых щипцов. После высыхания этанола нанесите 300 мкл 0,2 мг/мл поли-D-лизина (PDL) на лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C и 5% CO2.
    2. Стирайте покровные стекла 3 раза по 5 минут каждое с помощью DPBS последовательно. Снимите DPBS, нанесите 300 мкл 1 мкг/мл ламинина на покровные стекла и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C и 5% CO2.
    3. После трех этапов промывки DPBS в течение 5 минут замените DPBS на 190 мкл питательной среды DRG. Поместите 4-луночные планшеты в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2.
  3. Подготовка ДРГ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите DRG эмбриональных крыс под чистой скамьей.
    1. Перед подготовкой очистите все инструменты 70% этанолом. Наполните 10 (по две на эмбрион) 35-миллиметровых посуды TC 2 мл ледяного HBSS на блюдо, а две чашки TC 100 мм — 5 мл ледяного HBSS на блюдо.
    2. Усыпить беременных крыс (взрослых самок крыс Sprague Dawley, E13.5) путем вдыхания и обезглавливания CO2 .
    3. Опрыскайте на тело 70% этанолом и вскройте брюшное туловище крысы. Осторожно извлеките матку и поместите ее в 100-миллиметровую чашку TC с ледяным HBSS.
    4. Удерживайте матку с помощью изогнутых щипцов и открывайте стенки матки тонкими щипцами. Удалите один амниотический мешок и осторожно откройте его, защипнув отверстие тонкими щипцами.
    5. Удалите эмбрион из окружающих тканей, перережьте пуповину и обезглавьте эмбрион с помощью тонких щипцов. Поместите туловище в чашку TC диаметром 100 мм, заполненную HBSS, с помощью изогнутых щипцов и шпателя.
    6. Быстро удалите все эмбрионы из матки и перенесите их в одну чашку TC диаметром 100 мм, заполненную HBSS. Если эмбрионов более пяти, приготовьте дополнительную чашку TC диаметром 35 мм с 2 мл HBSS в соответствии с этапом 2.3.1.
    7. Аккуратно поместите один торс эмбриона в чашку TC диаметром 35 мм, наполненную HBSS, с помощью шпателя и изогнутых щипцов. Под стереомикроскопом откройте дорсальную часть туловища, чтобы разделить эмбрион на две половины с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поверните одну половину в сторону и определите нить DRG, расположенную в линию у дорсальной части эмбриона.
    8. Вырежьте DRG как целую прядь с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поместите DRG в свежую 35-миллиметровую чашку TC, заполненную 2 мл HBSS, и отделите одну DRG от оставшейся ткани с помощью тонких щипцов и микроножниц.
  4. Культура клеток DRG
    1. Возьмите 4-луночные планшеты, содержащие 190 мкл питательной среды DRG, из инкубатора на чистый стол, где должны быть приготовлены DRG. Аккуратно перенесите одну DRG в одну лунку 4-луночной культуральной пластины с помощью тонких щипцов и шпателя. Поместите ДРГ в центр каждой лунки, так как центральное положение важно для крепления ДРГ.
    2. Отныне работайте в стерильных условиях. Поместите эксплантные культуры в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. На следующий день осторожно добавьте 50 мкл питательной среды DRG в каждую лунку с помощью пипетки объемом 100 мл.
    3. Ежедневно наблюдайте за адгезией эксплантатов DRG и ростом аксонов с помощью микроскопа и отбрасывайте эксплантаты DRG, которые отделились от покровного стекла или не смогли перерасти аксоны на 3-й день культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплантаты DRG очень хрупкие в первые дни культивирования, и с ними нужно обращаться осторожно, особенно при перемещении тарелок в инкубатор и из него при смене среды или даже при закрытии дверцы инкубатора. Точный объем среды 190 мкл на лунку имеет решающее значение для поддержания эксплантатов DRG на месте в течение первого дня культивирования. Рыхлые эксплантаты DRG могут быть легко идентифицированы во время ежедневного контроля, так как они плавают в среде, а не прилипают к покровному стеклу.

3. Кокультура

  1. Перенос шванновских клеток в культуру эксплантата DRG
    1. Приготовьте среду для кокультуры, добавив 0,1% аскорбиновой кислоты в питательную среду DRG.
    2. На 3-й день культивирования эксплантата DRG осторожно замените питательную среду DRG на 250 мкл среды для кокультуры, содержащей 30 000 шванновских клеток (с шага 1.8) на лунку.
    3. Сохраняйте кокультуру эксплантатов DRG и шванновских клеток до 22 дней. Осторожно заменяйте 250 мкл среды для кокультуры через день и наблюдайте за внешним видом клеток с помощью микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример аксонов DRG и шванновских клеток в кокультуре в первые дни культивирования см. на рисунке 1.
  2. Иммуноцитохимическое окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень осторожно обращайтесь с образцами кокультуры во время процедуры окрашивания, так как их можно легко повредить.
    1. Чтобы зафиксировать ячейки на покровных стеклах, медленно удалите среду, тщательно промойте 3 раза DPBS и инкубируйте в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 10 минут. Замените PFA на DPBS и храните фиксированные ячейки при температуре 4 ° C до 1 недели.
      ВНИМАНИЕ: При работе с 4% ПФА надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты.
    2. Промойте покровные стекла 3 раза DPBS в течение 5 мин, затем заблокируйте блокирующим раствором (10% козья сыворотка, 10% бычий сывороточный альбумин [BSA], 0,1% желатин и 0,05% Triton X-100) в DPBS в течение 1 часа. Разбавляют первичные антитела βIII-тубулин (1:7,500) и основной белок миелина (МБП) (1:750) в блокирующем растворе и инкубируют в течение ночи при 4 °C.
    3. Промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS в течение 5 мин. Используйте флуоресцентные вторичные антитела, конъюгированные с красителем, в разведении 1:1000 в блокирующем растворе и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре (RT).
    4. Промойте клетки 3 раза с помощью DPBS в течение 5 минут и установите клетки на микроскопические предметные стекла с флуоресцентной монтажной средой, включая 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Хранить предметные стекла в темноте при температуре 4 °C до микроскопической документации.
      ВНИМАНИЕ: При работе с флуоресцентной монтажной средой надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты.
  3. Анализ
    1. Сфотографируйте восемь определенных областей, окружающих эксплантат DRG в центре, с помощью инвертированного микроскопа.
    2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки областей βIII-тубулиновых положительных аксонов и миелинизации, окрашенных MBP.
    3. Рассчитайте процент миелинизации как отношение миелинизированных аксонов и немиелинизированных аксонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Миелинизацию в кокультуре оценивали на 10, 12, 14, 16, 18 и 20 сутки. Эксплантаты DRG и шванновские клетки окрашивали на MBP, βIII-тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения. Первые признаки миелина в виде мелких фрагментов были обнаружены на 10-й день и усилились на 12-й день (рис. 2). Количество ПМБ-положительных областей увеличивалось с течением времени до 20-го дня культивирования. Количественно оценивали миелинизацию как соотно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представляем быстрый и простой протокол генерации миелинизации in vitro путем слияния двух отдельных культур клеточного типа, шванновских клеток и эксплантатов ганглиев дорсальных корешков.

Важнейшим этапом протокола является выращивание эксплантатов ДРГ, особенно в первые дни культуры. DRG очень хрупкие до того, как будет построена сильная аксональная сеть, и с ними нужно обращаться очень осторожно, например, при извлечении из инкубатора или во время смены среды. ДРГ, которы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим профессора д-ра Ральфа Голда и приват-доцента д-ра Гизу Эллрихманн за их советы и поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anti-MBP, кроликNovus Biologicals, Centannial, СШАABIN446360
Anti-ß III-тубулин, мышь Biolegend, Сан-Диего, США 657402
Аскорбиновая кислота Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия A4403-100MG
B27-добавкаThermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 17504-044
Наконечник для фильтра биосферы, 100 & микро; LSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Наконечник для биосферного фильтра, 1250 & микро; LSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Наконечник для биосферного фильтра, 20 & микро; LSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Наконечник для фильтра Biosphere, 300 & микро; LSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Бычий сывороточный альбуминCarl Roth, Карлсруэ, Германия 8076.4
Сетчатый фильтр для ячеек, 100 и микро; MBD Bioscience, Гейдельберг, Германия352360
Центрифуга 5810-REppendorf AG, Гамбург, Германия5811000015
CO2 инкубатор HeracellHeraeus Instruments, Ханау, Германия 
Покровные стекла 12 ммCarl Roth, Карлсруэ, Германия P231.1
Изогнутые тонкие щипцы Fine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия11370-42
DAPI fluoromount-G(R)Biozol, Eching, ГерманияSBA-0100-20
Dispase IISigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия 
Дистиллированная вода (система очистки воды) Millipore, Мольсхайм, ФранцияZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAXThermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
DPBS (без Ca2+ и без Mg2+)Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany D8537-6X500ML
ЭтанолVWR, Раднор, США 
FCSSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия F7524FCS должен быть протестирован на шванновскую клеточную культуру
Тонкие щипцы (Dumont #5)Fine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия11252-20
ЩипцыFine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия11370-40
ForskolinSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия F6886-10MG
ЖелатинSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия G1393-20ML
ГентамицинThermo Fisher Scientific, Шверте, Германия5710064
Козий антимышиный IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия A11036
Козий антикролиацкий IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия A11001
HBSS (без Ca2+ и без Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
Инкубатор HERAcellHeraeus Instruments, Ханау, Германия 
Heraguard ECO 1.2Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
Сыворотка для лошадейPan-Biotech, Айденбах, ГерманияP30-0712
Image J SoftwareHIH, Бетесда, США
LamininSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия L2020-1MG
Leibovitz´ s L-15 MediumThermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия 
L-глютамин 200 mM Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
MACS Multistand Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130042303
MicroscissorsFine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия15000-08
Микроскоп Motic, Wetzlar, ГерманияMotic BA 400
Microscope Axio observer 7Zeiss, Oberkochen, Германия 491917-0001-000
Предметное стекло для микроскопаVWR, Раднор, США 630-1985
Сепаратор MiniMACSMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130091632
Колонны MSMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-042-201
Счетная камера Neubauer Ассистент, Эрланген, Германия40441  
NeuregulinPeprotech, Роки Хилл, США100-03
Нейробазальная среда Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
NGFSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия N1408
Нормальная козья сывороткаBiozol, Эхинг, ГерманияS-1000
Nunclon & multidish, 4 лункиSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Германия D6789
ПараформальдегидAcros Organics, Нью-Джерси, США 
Пенициллин/СтрептомицинThermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 15140-122
PipetboyEppendorf AG, Гамбург, Германия4430000018 
ПипеткиEppendorf AG, Гамбург, Германия2231300004
Poly-D-LysinSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия P6407-5MG
поли-L-лизинSigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия P4707-50ML
Реакционные пробирки, 15  mLSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Реакционные трубки, 50  mLSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Реакционные сосуды, 1,5 млSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Шкаф безопасности S2020 1.8Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия 
ScissorsFine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия14083-08
Серологическая пипетка, 10 млSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Серологическая пипетка, 25 млSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Серологическая пипетка, 5 млSarstedt, Nü mbrecht, Германия 
SpatulaFine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия10094-13
Открытие стереомикроскопа.V8Zeiss, Оберкохен, Германия 495015-0012-000 
Хирургические ножницыFine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия14007-14
TC dish 100, cell +Sarstedt, Nü mbrecht, Германия 
TC тарелка 35, ячейка +Sarstedt, Nü mbrecht, Германия 
TC тарелка 60, ячейка +Sarstedt, Nü mbrecht, Германия 
Микрогранулы Thy-1 (набор MACS)Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-094-523
Triton X-100 Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия X100-500ML
Трипан Синий Раствор 0,4% Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия 
Трипсин (2,5%), без фенола красныйThermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия 15090-046
Трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красныйThermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия 25300-054
Коллагеназа типа ISigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия C1639
Водяная баня типа 1008GFL, Бургведель, Германия No 4285
7076021270118621070111421070765210510178654942078001313310931009862500141701385101786551029882114150642503002421103049103422436255450262547254726900015102664086125402586168500186125300183390230083390030083390130015250061

Ссылки

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652(2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781(2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58(2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145(2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Миелинизация периферических аксонов in vitro в кокультуре ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков крыс и шванновских клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.