Методическая статья

Тестирование эффективности in vitro и in vivo мРНК-липидных наночастиц, полученных путем микрофлюидного смешивания

DOI:

10.3791/64810

⸱

20 января 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол разработки липидных наночастиц (ЛНЧ), инкапсулирующих мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. Эти LNP были протестированы на их активность in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последнее время привлекли широкое внимание в связи с успешной разработкой мРНК-вакцин против COVID-19 компаниями Moderna и Pfizer/BioNTech. Эти вакцины продемонстрировали эффективность терапии на основе мРНК-ЛЯП и открыли двери для будущих клинических применений. В системах мРНК-ЛЯП ЛЯП служат платформами доставки, которые защищают груз мРНК от деградации нуклеазами и опосредуют их внутриклеточную доставку. LNP обычно состоят из четырех компонентов: ионизируемого липида, фосфолипида, холестерина и конъюгата полиэтиленгликоля (ПЭГ) с липидной привязкой (липид-ПЭГ). Здесь ЛЯП, инкапсулирующие мРНК, кодирующую люциферазу светлячка, образуются путем микрофлюидного смешивания органической фазы, содержащей липидные компоненты LNP, и водной фазы, содержащей мРНК. Затем эти мРНК-ЛНЧ тестируются in vitro для оценки эффективности их трансфекции в клетках HepG2 с помощью анализа на основе биолюминесцентной пластины. Кроме того, мРНК-LNP оценивают in vivo у мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции через боковую хвостовую вену. Биолюминесцентная визуализация всего тела выполняется с помощью системы визуализации in vivo . Приведены репрезентативные результаты для характеристик мРНК-ЛЯП, эффективности их трансфекции в клетках HepG2 и общего люминесцентного потока у мышей линии C57BL/6.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последние годы продемонстрировали большие перспективы в области невирусной генной терапии. В 2018 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый в мире препарат для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза 1,2,3,4 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции) Onpattro от Alnylam. Это был важный шаг вперед для липидных наночастиц и терапии на основе РНК. Совсем недавно компании Moderna и Pfizer/BioNTech получили одобрение FDA на свои вакцины мРНК-LNP против SARS-CoV-2 4,5. В каждой из этих терапий на основе ЛЯП нуклеиновых кислот ЛЯП служит для защиты груза от деградации нуклеазами и облегчения мощной внутриклеточной доставки 6,7. В то время как LNP успешно применяются в РНК-интерференционной терапии и применении вакцин, мРНК-LNP также были исследованы для использования в белковозаместительной терапии8, а также для совместной доставки мРНК Cas9 и направляющей РНК для доставки системы CRISPR-Cas9 для редактирования генов9. Тем не менее, не существует какой-то одной конкретной формулы, которая хорошо подходила бы для всех применений, и незначительные изменения в параметрах рецептуры LNP могут сильно повлиять на эффективность и биораспределение in vivo 8,10,11. Таким образом, для определения оптимальной рецептуры для каждой терапии на основе ЛНЧ необходимо разработать и оценить отдельные мРНК-ЛНЧ.

В состав LNP обычно входят четыре липидных компонента: ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и липидно-закрепленный конъюгат полиэтиленгликоля (ПЭГ) (липид-ПЭГ)11,12,13. Мощная внутриклеточная доставка, обеспечиваемая ЛНЧ, частично зависит от ионизируемого липидного компонента12. Этот компонент нейтрален при физиологическом рН, но становится положительно заряженным в кислой среде эндосомы11. Считается, что это изменение ионного заряда является ключевым фактором эндосомального побега12,14,15. В дополнение к ионизируемому липиду, фосфолипидный компонент (липид-хелпер) улучшает инкапсуляцию груза и способствует эндосомальному побегу, холестерин обеспечивает стабильность и усиливает слияние мембран, а липид-ПЭГ сводит к минимуму агрегацию и опсонизацию LNP в кровотоке10,11,14,16. Для создания LNP эти липидные компоненты объединяются в органическую фазу, как правило, этанол, и смешиваются с водной фазой, содержащей груз нуклеиновых кислот. Процесс разработки LNP очень универсален в том смысле, что он позволяет легко заменять и комбинировать различные компоненты при различных молярных соотношениях для создания множества рецептур LNP с множеством физико-химических свойств10,17. Тем не менее, при изучении этого огромного разнообразия LNP крайне важно, чтобы каждая рецептура оценивалась с использованием стандартизированной процедуры для точного измерения различий в характеристиках и эксплуатационных характеристиках.

В этой статье описывается полный рабочий процесс по составлению мРНК-ЛНЧ и оценке их эффективности в клетках и на животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда поддерживайте условия, свободные от РНКазы при составлении мРНК-LNP, протирая поверхности и оборудование дезинфицирующим средством для РНКаз и ДНК. Используйте только наконечники и реагенты, не содержащие РНКазы.

Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных в Университете Пенсильвании и протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Университете Пенсильвании.

1. Подготовка предварительной рецептуры

  1. Наполните чистый стакан объемом 4 л 200-300 мл свежего 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS).
    1. Разбавьте 10x PBS в стакане в 10 раз сверхчистой водой, чтобы получить стакан 1x PBS. Убедитесь, что окончательный объем 1x PBS составляет 2-3 л.
    2. Поместите диализные кассеты (20 кДа молекулярной массы [MWCO]) соответствующей емкости для состава LNP в заполненный стакан для их гидратации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализные кассеты требуют не менее 2 минут для гидратации перед использованием.
    3. Поместите перемешиватель в стакан и накройте стакан алюминиевой фольгой.
    4. Поместите накрытый стакан на магнитную пластину для перемешивания. Включите пластину для перемешивания и установите ее на вращение со скоростью 300-400 оборотов в минуту.
  2. Разбавьте 100 мМ лимонной кислоты (рН 3) в 10 раз сверхчистой водой, чтобы создать 10 мМ буфера лимонной кислоты, используемого для разведения мРНК.
  3. Приготовьте исходные растворы ионизируемых липидов, хелперных липидов, холестерина и липид-якорных ПЭГ (липид-ПЭГ) C12-200, растворив каждый липид в 100% этаноле. Концентрации липидных компонентов подробно описаны в таблице 1.
    1. Нагрейте и перемешайте исходные растворы при температуре 37 °C, чтобы обеспечить их полное растворение.

2. Приготовление смесей липидов и нуклеиновых кислот

  1. Рассчитайте необходимые объемы ионизируемых липидов, хелперных липидов, холестерина и липид-ПЭГ на основе желаемого молярного соотношения и массового отношения ионизируемого липида к массе мРНК (табл. 1). Приготовьте 10% дополнительного объема органической фазы, чтобы учесть мертвый объем в шприцах во время составления рецептуры.
    1. Объедините рассчитанные объемы различных липидных компонентов в конической пробирке.
    2. Разбавьте липиды 100% этанолом до конечного объема V, который составляет 25% от конечного объема LNP.
  2. Рассчитайте количество мРНК, необходимое для составления препарата, исходя из весового соотношения ионизируемых липидов и мРНК и общего объема необходимой мРНК-ЛЯП (таблица 1).
    1. Разморозьте мРНК, кодирующую люциферазу, на льду.
    2. Разбавьте мРНК до конечного объема, 3В, в три раза превышающего объем органической фазы, в буфере лимонной кислоты 10 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый объем липидов, V, должен содержать достаточное количество ионизируемого липида для мРНК, разбавленной в 3В. Это соответствует желаемому массовому соотношению ионизируемых липидов и мРНК.

3. Микрофлюидная рецептура мРНК-ЛЯП

  1. Распылите на деликатную салфетку дезинфицирующее средство для РНКаз и ДНК и тщательно протрите внутреннюю часть микрофлюидного прибора.
    1. Откройте новый микрофлюидный картридж и вставьте его впускными каналами вниз и в сторону.
    2. Убедитесь, что кронштейн конической пробирки удерживает две конические пробирки объемом 15 мл и находится в крайнем правом положении.
    3. Установите две стерильные конические пробирки объемом 15 мл на держателе со снятыми крышками.
  2. Наполните шприц объемом 5 мл раствором мРНК, содержащим мРНК, разведенную в 10 мМ буфере лимонной кислоты.
    1. Наполните шприц объемом 3 мл липидным раствором, содержащим липиды, разведенные в чистом 100% этаноле.
    2. Откиньте держатель картриджа на микрофлюидном устройстве.
    3. Вставьте шприц объемом 5 мл без иглы, содержащий мРНК, в левое входное отверстие картриджа.
    4. Вставьте шприц объемом 3 мл без иглы, содержащий липиды, в правое входное отверстие картриджа.
    5. Переверните держатель картриджа вниз и закройте крышку микрофлюидного прибора.
  3. Включите микрофлюидный прибор с помощью переключателя, расположенного на задней панели прибора.
    1. Выберите Быстрый запуск.
    2. Выберите правильные типы шприцев для вставленных шприцев объемом 5 мл и 3 мл.
    3. Введите параметры для рецептуры мРНК-ЛЯП при соотношении водного и органического потока 3:1, как описано в таблице 2.
    4. Нажмите кнопку «Далее », чтобы перейти к следующему экрану.
    5. Убедитесь, что введены правильные параметры.
    6. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы сформулировать мРНК-ЛЯП.

4. Пострецептурная обработка и характеризация мРНК-ЛЯП

  1. Загрузите мРНК-ЛЯП, собранные в правую коническую пробирку, в предварительно гидратированные диализные кассеты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прокалывайте и не повреждайте мембрану кассеты при загрузке мРНК-ЛЯП. Если мембрана повреждена, мРНК-ЛЯП будут потеряны при нагрузке.
    1. Поместите диализные кассеты, содержащие мРНК-LNP, обратно в стакан, содержащий 1x PBS, и оставьте их для диализа минимум на 2 часа.
    2. После диализа диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, поместить в стерильный шкаф биобезопасности и удалить мРНК-ЛЯП с помощью шприца с иглой.
    3. Стерильно отфильтруйте мРНК-ЛЯП с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и соберите их в стерильную коническую пробирку.
    4. Поместите 65 мкл раствора мРНК-ЛЯП в микропробирку объемом 1,5 мл для характеризации.
  2. Развести 10 мкл мРНК-ЛЯП 1:100 в 990 мкл 1x PBS в кювете для измерения гидродинамического размера и показателя полидисперсности с использованием динамического рассеяния света.
  3. Оцените концентрацию и эффективность инкапсуляции мРНК-ЛЯП с помощью флуоресцентного анализа (например, RiboGreen).
    1. Приготовьте исходный раствор 1x TE буфера, разбавив 20x TE буфер молекулярно-биологической водой.
    2. Приготовьте исходный раствор 1% буфера Triton X-100, разбавив Triton X-100 буфером 1x TE.
    3. Приготовьте флуоресцентный реагент, разбавив запас реагента 1:200 буфером 1x TE.
    4. Разбавляют мРНК-LNP в соотношении 1:100 в 1x TE буфере и 1% буфере Triton X-100 в 96-луночном планшете с черными стенками и черным дном в 100 мкл.
    5. Подготовьте стандартную кривую низкого диапазона, разбавив стандарт РНК в соответствии с инструкциями производителя, и поместите стандартную кривую в 96-луночный планшет.
    6. Добавьте 100 мкл разбавленного флуоресцентного реагента в каждую лунку, содержащую разбавленную мРНК-LNP или разбавленный стандарт.
    7. Поместите 96-луночный планшет в устройство для чтения пластин и встряхивайте в течение 1 минуты, а затем подождите 4 минуты.
    8. Измерьте интенсивность флуоресценции каждой лунки в соответствии с протоколом производителя при возбуждении/излучении 480 нм/520 нм.
  4. Используйте стандартную кривую для преобразования значений флуоресценции в концентрации.
    1. Рассчитайте эффективность инкапсуляции путем вычитания значения, полученного при разбавлении LNP в TE-буфере (неинкапсулированная мРНК), из значения, полученного при разбавлении LNP в 1% Triton X-100 (общая мРНК) и деления на значение, полученное при разбавлении LNP в 1% Triton X-100, согласно уравнению 4.4.
    2. Рассчитайте концентрацию мРНК-LNP, используемую для исследований на клетках и животных, путем вычитания значения, полученного при разбавлении LNP в TE-буфере (неинкапсулированная мРНК), из значения, полученного при разбавлении LNP в 1% Triton X-100 (общее количество мРНК).
  5. Измерьте pKa мРНК-LNP, выполнив анализ 6-(p-толуидино)-2-нафталинсульфонилхлорида (TNS).
    1. Приготовьте реагент TNS, создав 0,16 мМ раствор TNS в сверхчистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании реагента обязательно держите его на льду и вдали от света, чтобы избежать разложения.
    2. Готовят буферные растворы 150 мМ хлорида натрия, 20 мМ фосфата натрия, 25 мМ цитрата аммония и 20 мМ ацетата аммония, адаптированные к различным значениям рН в диапазоне от 2 до 12 с шагом 0,5.
    3. Добавьте 2,5 мкл LNP в каждый буферный раствор с регулируемым pH в 96-луночном планшете с черными стенками и черным дном.
    4. Добавьте реагент TNS в каждую лунку так, чтобы конечная концентрация TNS составляла 6 мкМ.
    5. Инкубируйте 96-луночную пластину в темном месте в течение 5 минут.
    6. Измерьте флуоресценцию при возбуждении/излучении 322 нм/431 нм с помощью флуоресцентного планшетного ридера.
    7. Подгоните данные к сигмоидальной кривой и вычислитеpKa с помощью подогнанного уравнения, чтобы найти pH, при котором наблюдалось 50% максимальной интенсивности.
  6. Репрезентативные результаты для гидродинамического размера мРНК-ЛЯП, PDI, эффективности инкапсуляции и pKa приведены в таблице 3.

5. Трансфекция клеток HepG2 in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные другие клеточные линии, такие как клетки HeLa или клетки HEK-293T, могут быть использованы для оценки эффективности трансфекции LNP in vitro. Все клетки должны получить отрицательный результат на микоплазму перед исследованиями трансфекции LNP.

  1. Планшет по 5 000 клеток HepG2 в каждой лунке 96-луночного планшета с белым дном и прозрачным дном в 100 мкл полной питательной среды клеток (DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина)
    1. Оставьте клетки на ночь в контролируемом инкубаторе СО2 при температуре 37 °C и 5%СО2.
  2. Разбавляют мРНК-ЛНЧ в полной питательной среде клеток так, чтобы общая доза составляла 100 мкл.
    1. Удалите всю среду из лунок.
    2. Обрабатывают клетки либо мРНК-ЛНЧ, разведенными в полной питательной среде клеток в желаемых дозах, либо полной средой (контроль).
    3. Поместите 96-луночную пластину, содержащую обработанные клетки, обратно в контролируемый инкубаторCO2 на 24 часа.
  3. Оцените эффективность трансфекции, выполнив люциферазный анализ.
    1. Приготовьте реагент люциферазы и 1x буфер для лизиса клеток в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Выньте из инкубатора 96-луночную пластину, содержащую клетки, и отнесите ее в шкаф биобезопасности.
    3. Удалите питательную среду из каждой лунки 96-луночного планшета.
    4. Добавьте 20 мкл 1x лизисного буфера в каждую лунку, а затем 100 мкл ранее приготовленного реагента для анализа люциферазы.
    5. Защитите планшет от света и поместите планшет в считыватель пластин для измерения биолюминесцентного сигнала каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты, демонстрирующие лечение клеток HepG2 ранее разработанными мРНК-ЛНП C12-200, показаны на рисунке 1.

6. Оценка in vivo мРНК-ЛЯП у мышей после инъекции в хвостовую вену

  1. Разбавляют раствор мРНК-ЛНП стерильным 1x PBS таким образом, чтобы в объеме 100 мкл для инъекции в хвостовую вену присутствовало 2 мкг общей мРНК, что соответствует дозе массы тела примерно 0,1 мг/кг для мыши весом 20 г.
  2. Удерживайте каждую мышь утвержденным методом, а хвост протирайте подушечкой, смоченной 70% спиртом.
    1. Наполните инсулиновый шприц 29 г либо 100 мкл мРНК-ЛНП (2 мкг), либо 100 мкл 1x PBS. Удалите пузырьки из шприца.
    2. Введите иглу скосом вверх в боковую хвостовую вену мыши и медленно введите 100 мкл мРНК-LNP или 1x PBS.
    3. Извлеките иглу и надавливайте до достижения гемостаза.
  3. Приготовьте исходный раствор 15 мг/мл д-люцифериновой калиевой соли в стерильном 1x PBS через 6 часов после инъекции.
    1. Включите систему визуализации in vivo (IVIS) и откройте программное обеспечение для обработки изображений.
    2. Нажмите кнопку Инициализировать, чтобы подготовить прибор к сбору данных.
    3. Установите флажок рядом с люминесценцией и установите время экспозиции на авто. Убедитесь, что выбрано правильное поле зрения для количества мышей, которые получают изображение.
    4. Вводят 200 мкл d-люциферина внутрибрюшинно (150 мг люциферина на кг массы тела) мышам, ранее получавшим лечение.
    5. Поместите мышей в наркозную камеру с содержанием изофлурана 2,5% и расходом кислорода 2,0 л/мин.
    6. Подождите 10 минут, пока сигнал люциферазы стабилизируется, прежде чем визуализировать мышей, обработанных мРНК-LNP.
    7. Убедитесь, что мыши полностью обезболены, и перенаправьте анестезиологическую линию для введения изофлурана через носовые конусы внутри камеры визуализации.
    8. Перенесите мышей на носовые конусы и убедитесь, что они лежат на спине с открытым животом.
    9. Закройте дверцу камеры и нажмите кнопку «Получить » в программном обеспечении, чтобы получить изображения биолюминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты визуализации всего тела мышей после лечения мРНК-LNP или 1X PBS показаны на рисунке 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

мРНК-ЛЯП были созданы с помощью микрофлюидного прибора, обладающего средним гидродинамическим диаметром 76,16 нм и индексом полидисперсности 0,098. При проведении анализа TNS18 было установлено, что p K a мРНК-LNP составляет 5,75. Эффективность инкапсуляции этих мРНК-ЛЯП была рассчитана на уровне 92,3% с использованием модифицированного флуоресцентного анализа и уравнения 4.4. Общая концентрация РНК, которая использовалась для лечения клеток и дозирования живот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью этого рабочего процесса можно сформулировать и протестировать различные мРНК-ЛЯП на предмет их эффективности in vitro и in vivo. Ионизируемые липиды и вспомогательные вещества могут быть заменены и комбинированы при различных молярных соотношениях и различном массовом соотношении ионизируемых липидов и мРНК для получения мРНК-LNP с различными физико-химическими свойствами22. Здесь мы разработали мРНК-LNP C12-200 с молярным отношением 35/16/46,5/2,5 (ионизируемый липид:л...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.M. выражает признательность за поддержку со стороны премии директора Национального института здравоохранения США (NIH) «Новый новатор» (DP2 TR002776), премии Burroughs Wellcome Fund Career Award в Scientific Interface (CASI), премии CAREER Национального научного фонда США (CBET-2145491) и дополнительного финансирования от Национальных институтов здравоохранения (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 и NIDDK R01 DK123049).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 м соляная кислотасигма7647-01-0
0,22 мкм; m Шприцевые фильтрыGenesee25-243
1 мл BD Шприц со скользящим наконечникомBD309659
1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония) (C14-PEG2000)Avanti Polar Lipids880150P
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE)Avanti Polar Lipids850725P
1.5 mL Eppendorf TubesFisher Scientific05-408-129
15 мл Конические пробиркиFisher Scientific14-959-70C
200 proofEthanol Decon Labs2716
23G ИглыFisher Scientific14-826-6C
3 мл BD Одноразовые шприцы с наконечниками Luer-LokFisher Scientific14-823-435
3 мл Диализ КассетыThermo ScientificA52976
96 Well Black Wall Черная нижняя пластинаFisher Scientific07-000-135
96 Well Белая/Прозрачная нижняя пластина, TC SurfaceThermo Scientific165306
ацетат аммония, 1 килограммResearch Products International  631-61-8
Двухосновной цитрат аммонияSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Шприц стерильный, одноразового использования, 5 млBD309646
C12-200 Ионизируемый липидCayman Chemical36699
C57BL/6 мышиJackson Laboratory000664
холестеринаSigma57-88-5
CleanCap FLuc мРНК (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
Одноразовые кюветыFisher Scientific14955129
D-люциферин, калийная сольThermo ScientificL2916
DMEM, с высоким содержанием глюкозыThermofisher Scientific11965-084
Exel инсулиновые шприцы - 0,5 млFisher Scientific1484132
Фетальная бычья сывороткаCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Молекулярная биология Класс ВоднаяЦитиваSH30538.03
Infinite 200 PRO Планшетный ридерTecanN/A
Ivis Spectrum In vivo Система визуализацииPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
Набор для анализа люциферазыPromegaE4550
NanoAssemblr Картриджи Ignite - Classic - Упаковка 100прецизионных наносистемNIN0065
NanoAssemblr Ignite InstrumentПрецизионные наносистемыNIN0001
PBS - фосфатно-солевой буфер (10x) pH 7,4, без РНКазыThermo ScientificAM9624
Пенициллин-стрептомицинThermofisher Scientific15140122
QB цитратный буфер, (цитрат 100 мМ) pH 3.0TeknovaQ2442
quant-it RiboGreen RNA AnasayKit Thermo ScientificR11490
Reporter Lysis 5x BufferPromega E3971
РНКаза Away Поверхностное обеззараживаниеThermofisher Scientific7000TS1
Хлорид натрияSigma7647-14-5
Гидроксид натрияSigma1310-73-2
Фосфат натрияSigma7601-54-9
TNS реагент (6-(-толуидино)-2-нафталинсульфоновая кислота натриевая соль)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern PanalyticalNanoZS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  2. Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509(2018).
  3. Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
  4. Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
  5. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  6. Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
  7. Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
  8. Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
  9. Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118(2021).
  10. Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
  11. El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111(2021).
  12. Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983(2020).
  13. Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
  14. Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
  15. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
  16. Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
  17. Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161(2020).
  18. Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
  19. Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
  20. Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
  21. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  22. Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
  23. Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
  24. Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
  25. Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
  26. Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279(2013).
  27. Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
  28. Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
  29. Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  30. Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
  31. Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308(2018).
  32. Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
  33. Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493(2018).
  34. Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095(2022).
  35. Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
  36. Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
  37. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  38. Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
  39. Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
  40. Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroin vivoHepG2

Похожие статьи