Представлен протокол разработки липидных наночастиц (ЛНЧ), инкапсулирующих мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. Эти LNP были протестированы на их активность in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Тестирование эффективности in vitro и in vivo мРНК-липидных наночастиц, полученных путем микрофлюидного смешивания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последнее время привлекли широкое внимание в связи с успешной разработкой мРНК-вакцин против COVID-19 компаниями Moderna и Pfizer/BioNTech. Эти вакцины продемонстрировали эффективность терапии на основе мРНК-ЛЯП и открыли двери для будущих клинических применений. В системах мРНК-ЛЯП ЛЯП служат платформами доставки, которые защищают груз мРНК от деградации нуклеазами и опосредуют их внутриклеточную доставку. LNP обычно состоят из четырех компонентов: ионизируемого липида, фосфолипида, холестерина и конъюгата полиэтиленгликоля (ПЭГ) с липидной привязкой (липид-ПЭГ). Здесь ЛЯП, инкапсулирующие мРНК, кодирующую люциферазу светлячка, образуются путем микрофлюидного смешивания органической фазы, содержащей липидные компоненты LNP, и водной фазы, содержащей мРНК. Затем эти мРНК-ЛНЧ тестируются in vitro для оценки эффективности их трансфекции в клетках HepG2 с помощью анализа на основе биолюминесцентной пластины. Кроме того, мРНК-LNP оценивают in vivo у мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции через боковую хвостовую вену. Биолюминесцентная визуализация всего тела выполняется с помощью системы визуализации in vivo . Приведены репрезентативные результаты для характеристик мРНК-ЛЯП, эффективности их трансфекции в клетках HepG2 и общего люминесцентного потока у мышей линии C57BL/6.
Введение
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последние годы продемонстрировали большие перспективы в области невирусной генной терапии. В 2018 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый в мире препарат для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза 1,2,3,4 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции) Onpattro от Alnylam. Это был важный шаг вперед для липидных наночастиц и терапии на основе РНК. Совсем недавно компании Moderna и Pfizer/BioNTech получили одобрение FDA на свои вак....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда поддерживайте условия, свободные от РНКазы при составлении мРНК-LNP, протирая поверхности и оборудование дезинфицирующим средством для РНКаз и ДНК. Используйте только наконечники и реагенты, не содержащие РНКазы.
Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных в Университете Пенсильвании и протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Университете Пенсильвании.
1. Подготовка предварительной рецептуры
- Наполните чистый стакан объемом 4 л 200-300 мл свежего 10-кратного ф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
мРНК-ЛЯП были созданы с помощью микрофлюидного прибора, обладающего средним гидродинамическим диаметром 76,16 нм и индексом полидисперсности 0,098. При проведении анализа TNS18 было установлено, что p K a мРНК-LNP составляет 5,75. Эффективность инкапсуляции этих мРНК-ЛЯП была рассчитана на уровне 92,3% с использованием модифицированного флуоресцентного анализа и уравнения 4.4. Общая концентрация РНК, которая использовалась для лечения клеток и дозирования живот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С помощью этого рабочего процесса можно сформулировать и протестировать различные мРНК-ЛЯП на предмет их эффективности in vitro и in vivo. Ионизируемые липиды и вспомогательные вещества могут быть заменены и комбинированы при различных молярных соотношениях и различном массовом соотношении ионизируемых липидов и мРНК для получения мРНК-LNP с различными физико-химическими свойствами22. Здесь мы разработали мРНК-LNP C12-200 с молярным отношением 35/16/46,5/2,5 (ионизируемый липид:л.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.
Благодарности
M.J.M. выражает признательность за поддержку со стороны премии директора Национального института здравоохранения США (NIH) «Новый новатор» (DP2 TR002776), премии Burroughs Wellcome Fund Career Award в Scientific Interface (CASI), премии CAREER Национального научного фонда США (CBET-2145491) и дополнительного финансирования от Национальных институтов здравоохранения (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 и NIDDK R01 DK123049).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,1 м соляная кислота | сигма | 7647-01-0 | |
| 0,22 мкм; m Шприцевые фильтры | Genesee | 25-243 | |
| 1 мл BD Шприц со скользящим наконечником | BD | 309659 | |
| 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 мл Конические пробирки | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof | Ethanol Decon Labs | 2716 | |
| 23G Иглы | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 мл BD Одноразовые шприцы с наконечниками Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 мл Диализ Кассеты | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Черная нижняя пластина | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well Белая/Прозрачная нижняя пластина, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| ацетат аммония, 1 килограмм | Research Products International | 631-61-8 | |
| Двухосновной цитрат аммония | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Шприц стерильный, одноразового использования, 5 мл | BD | 309646 | |
| C12-200 Ионизируемый липид | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 мыши | Jackson Laboratory | 000664 | |
| холестерина | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc мРНК (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Одноразовые кюветы | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-люциферин, калийная соль | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, с высоким содержанием глюкозы | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel инсулиновые шприцы - 0,5 мл | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Молекулярная биология Класс Водная | Цитива | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Планшетный ридер | Tecan | N/A | |
| Ivis Spectrum In vivo Система визуализации | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Набор для анализа люциферазы | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Картриджи Ignite - Classic - Упаковка 100 | прецизионных наносистем | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Прецизионные наносистемы | NIN0001 | |
| PBS - фосфатно-солевой буфер (10x) pH 7,4, без РНКазы | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB цитратный буфер, (цитрат 100 мМ) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| quant-it RiboGreen RNA Anasay | Kit Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega E3971 | ||
| РНКаза Away Поверхностное обеззараживание | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Хлорид натрия | Sigma | 7647-14-5 | |
| Гидроксид натрия | Sigma | 1310-73-2 | |
| Фосфат натрия | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS реагент (6-(-толуидино)-2-нафталинсульфоновая кислота натриевая соль) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
Ссылки
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
