Методическая статья

Стратегии скрининга малых молекул от идентификации свинца до валидации

923 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64811

⸱

20 января 2023 г.

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

В этой статье

Аннотация

ОБСУЖДАЕМЫЕ СТАТЬИ:

Феста, Ф., Лабаер, Д. Скрининг ингибиторов киназы в самоорганизующихся микрочипах человеческого белка. Журнал визуализированных экспериментов. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Анализы активности на основе ЯМР для определения ингибирования соединений, значений IC50, артефактуальной активности и активности нуклеозидрибогидролаз во всей клетке. Журнал визуализированных экспериментов. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. Высокопроизводительный анализ для прогнозирования химической токсичности путем автоматизированного фенотипического профилирования Caenorhabditis elegans. Журнал визуализированных экспериментов. 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Использование визуализации с высоким содержанием для количественной оценки вовлечения мишени в адгезивных клетках. Журнал визуализированных экспериментов. 141, e58670 (2018).

Чорба, Д. С., Галван, А. М., Шокат, К. М. Высокопроизводительный анализ люциферазы для оценки протеолиза однооборотной протеазы PCSK9. Журнал визуализированных экспериментов. 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Использование моделей вирусных инфекций гриппа А человека для скрининга противовирусных препаратов и характеристики реакций иммунных клеток хозяина. Журнал визуализированных экспериментов. 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Оценка резистентности к ингибиторам тирозинкиназы путем опроса путей передачи сигнала с помощью антител. Журнал визуализированных экспериментов. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Полувысокопроизводительная адаптация NADH-связанного анализа АТФазы для скрининга низкомолекулярных ингибиторов. Журнал визуализированных экспериментов. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Разработка ингибиторов белок-белковых взаимодействий с помощью REPLACE: Применение для проектирования и разработки не-ATP конкурентных ингибиторов CDK. Журнал визуализированных экспериментов. 104, e52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Идентификация медиаторов передачи сигналов Т-клеточных рецепторов с помощью скрининга библиотек химических ингибиторов. Журнал визуализированных экспериментов. 143, e58946 (2019).

Такакусаги, Ю. Стратегия высокопроизводительного биопанирования и биоинформатического анализа на основе биосенсоров для глобальной валидации лекарственных и белковых взаимодействий. Журнал визуализированных экспериментов. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Высокопроизводительное клеточное профилирование целевых белковых деградационных соединений с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR. Журнал визуализированных экспериментов. 165, e61787 (2020).

Редакционная статья

Революция в геномике привела к огромному объему знаний о связи между генетическими возмущениями и различнымифенотипами заболеваний. Это привело к тому, что многие белки были объявлены потенциальными мишенями для лекарств и подстегнуло интерес к открытию и разработке соединений, которые ингибируют эти мишени. В этом контексте различные стратегии скрининга стали важными подходами к обнаружению хит-соединений, валидации мишени, измерению аффинности связывания, селективности, токсичности и вовлечения мишени в клетке, а также реакционной способности, стабильности и фармакокинетических свойств соединений. В этой коллекции собраны некоторые методологические достижения в этой области с целью демонстрации множества стратегий, которые могут быть использованы для скрининга и оценки биохимической и/или биологической активности малых молекул.

Протеинкиназы представляют собой большое семейство ферментов, насчитывающее более 500 членов. Эти ферменты являются ключевыми регуляторами всех клеточных процессов, и их сбой связан с многочисленными заболеваниями3. Таким образом, они оказались в центре пристального интереса к открытию лекарств и, как следствие, к разработке методологии. Таким образом, четыре статьи в этом сборнике рассказывают о достижениях в этой области. Festa et al. описывают скрининговую платформу для открытия ингибиторов киназы, в которой используются самоорганизующиеся программируемые белковые матрицы нуклеиновых кислот (NAPPA)4. Эти матрицы отображают полноразмерные киназы человека и позволяют проводить мультиплексный скрининг соединений в большой коллекции киназ, что позволяет не только идентифицировать попадания, но и профилировать селективность. Tieman et al. описывают метод на основе микрочипов фосфоантител, разработанный для скрининга изменений статуса фосфорилирования в масштабах всей клетки как считывание активности ингибитора киназы5. Это может привести к пониманию природы путей, которые стали устойчивыми к ингибированию, что является важным параметром, имеющим отношение к пониманию реакции на лекарственные препараты и их эффективности. Chen et al. описывают анализ проточной цитометрии для скрининга коллекций ингибиторов киназы для идентификации соединений, влияющих на передачу сигналов Т-клеточного рецептора (TCR)6. Эта стратегия привела к быстрой идентификации киназ, участвующих в передаче сигналов TCR, что указывает на их потенциал в качестве мишеней для разработки иммунотерапевтических препаратов. Наконец, активность многих киназ регулируется через белок-белковые взаимодействия (ИПП), что позволяет предположить, что соединения, нацеленные на эти ИПП, могут представлять интерес. Nandha Premnath et al. описывают метод под названием REPLACE (замена частичными альтернативами лигандов с использованием вычислительного обогащения), который может быть использован для разработки неАТФ-конкурентных PPI киназ путем преобразования особенностей пептидных связывающих веществ в малые молекулы, которые взаимодействуют с тойже поверхностью связывания.

В дополнение к киназам, многие другие ферменты играют роль в развитии заболеваний и используются при разработке лекарств. Поэтому представляют интерес и методы, оптимизированные для ферментов, отличных от киназ. Например, Stockman et al. описывают анализы активности на основе спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для обнаружения и оценки ингибиторов нуклеозидрибогидролаз из паразита Trichomonas vaginalis8. Эти анализы также могут быть использованы для определения значений IC50 . Для скрининга ингибиторов АТФазы Radnai et al. разработали метод скрининга с полувысокой пропускной способностью, в котором используется формат сопряженного ферментного анализа с участием двух ферментов (пируваткиназы и лактатдегидрогеназы), который в конечном итоге транслирует активность АТФазы во внутреннюю флуоресценцию никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) в виде считывания9. В отличие от всех описанных до сих пор ферментов, которые являются процессными и катализируют несколько стадий, пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) представляет собой протеазу с однократным оборотом, которая аутоингибируется своим субстратом. Это затрудняет скрининг ингибиторов PCSK9, и Chorba et al. описывают высокопроизводительный клеточный метод, который связывает активность расщепления PCSK9 с секретируемой активностью люциферазы в виде показаний, что позволяет проводить скрининг на ингибиторы10.

В дополнение к обнаружению соединений, которые ингибируют активность различных мишеней, анализы, которые подтверждают, что соединение взаимодействует со своей предполагаемой мишенью в клетках, также представляют большой интерес. Axelsson et al. описывают стратегию валидации вовлечения мишени в адгезивных клетках, основанную на сочетании визуализации с высоким содержанием иммунофлуоресцентных антител и анализа клеточного теплового сдвига (CETSA)11. В этом анализе используется изотермический тепловой вызов клеткам, обработанным большой коллекцией соединений, для идентификации стабилизирующих соединений. Метод, который может оценить вовлечение мишени и активность молекул-деградеров, разработанный Riching et al., использует технологию мечения HiBiT/LgBiT для получения люминесцентного белка и мониторинга параметров деградации за счет снижения люминесценции12. Наконец, Takakusagi et al. описывают метод валидации белок-лекарственных взаимодействий, основанный на использовании пептидных дисплеев на основе фагов для скрининга связывания между мотивами пептидов, связывающих лекарственные средства, и малымимолекулами. Экран дисплея пептидов сочетается с биоинформационным анализом для проверки связывания мишени.

Еще одним уровнем валидации малых молекул является характеристика их эффектов на животных моделях. Эта коллекция включает два таких метода, один из которых использует модели вирусной инфекции гриппа А человека на рыбках данио (Danio rerio) для оценки эффективности соединений с противовирусной активностью, а также иммунного ответа хозяина14, а другой использует Caenorhabditis elegans в качестве модели для профилирования токсичности соединений15. Оба эти исследования подчеркивают необходимость оптимизированных методов, которые могут оценить эффективность и токсичность in vivo.

В заключение следует отметить, что поиск и разработка лекарств — это сложный процесс с многочисленными узкими местами, проблемами и высокой вероятностью неудачи. Кроме того, продолжающееся бремя болезней, будь то в области инфекционных заболеваний, где число устойчивых к лекарствам патогенов растет с угрожающей скоростью, или в районах с растущей распространенностью хронических заболеваний и болезней, связанных со старением населения, требует нашего пристального внимания и действий. В этой коллекции выделено несколько методов, направленных на ускорение открытия, валидации и характеризации лекарств. В будущем мы ожидаем увидеть дальнейшие инновации в этой области, особенно те, которые направлены на повышение пропускной способности скрининга, увеличение разнообразия химических библиотек и разработку моделей in vivo , совместимых с высокопроизводительным скринингом (HTS). Кроме того, особенно полезными могут быть рабочие процессы, которые обеспечивают целостное представление о потенции, селективности, специфичности, эффективности и токсичности в более быстром и меньшем масштабе.

Раскрытие информации

М.К. является оплачиваемым консультантом для редакторов Life Science.

Благодарности

M.K. частично поддерживается NCI T32 CA236754.

Ссылки

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

Похожие статьи