Методическая статья

Иммунопреципитация хроматина в модельной системе Книдария Exaiptasia diaphana

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64817

⸱

17 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red Sea Research Center (RSRC), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 2KAUST Environmental Epigenetics Program (KEEP), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представлен иммунопреципитативный анализ хроматина (X-ChIP) против гистоновой метки H3K4me3 для модельного организма Exaiptasia diaphana . Специфичность и эффективность анализа подтверждены количественной ПЦР и секвенированием нового поколения. Этот протокол позволяет расширить исследования белок-ДНК-взаимодействий в актрении E. diaphana.

Аннотация

Посттрансляционные модификации гистонов (ПТМ) и другие эпигенетические модификации регулируют доступность хроматина генов к транскрипционному механизму, тем самым влияя на способность организма реагировать на стимулы окружающей среды. Иммунопреципитация хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChIP-seq) широко используется для идентификации и картирования белок-ДНК-взаимодействий в области эпигенетики и регуляции генов. Тем не менее, эпигенетика книдарий затруднена отсутствием применимых протоколов, отчасти из-за уникальных особенностей модельных организмов, таких как симбиотическая актиния Exaiptasia diaphana, высокое содержание воды и количество слизи в котором препятствуют молекулярным методам. Здесь представлена специализированная процедура ChIP, которая облегчает исследование белок-ДНК-взаимодействий в регуляции гена E. diaphana . Этапы сшивания и экстракции хроматина были оптимизированы для эффективного иммунопреципитации, а затем валидированы путем проведения ChIP с использованием антитела против гистоновой метки H3K4me3. Впоследствии специфичность и эффективность анализа ChIP были подтверждены путем измерения относительной занятости H3K4me3 вокруг нескольких конститутивно активированных локусов генов с помощью количественной ПЦР и секвенирования нового поколения для анализа в масштабе всего генома. Этот оптимизированный протокол ChIP для симбиотических актиний E. diaphana облегчает исследование белково-ДНК-взаимодействий, участвующих в реакциях организмов на изменения окружающей среды, которые влияют на симбиотических книдарий, таких как кораллы.

Введение

В докладе Межправительственной группы экспертов по изменению климата (МГЭИК) за 2022 год подчеркивается, что, несмотря на растущую осведомленность и усилия по смягчению последствий, все более интенсивные и частые морские волны тепла подвергают коралловые рифы высокому риску обширного обесцвечивания и массовой гибели в течениеследующих десятилетий1. В целях информирования о мерах по сохранению и восстановлению коралловых рифов текущие и прогнозируемые последствия изменения условий окружающей среды для бентических книдарий исследуются на различных биологических уровнях, чтобы понять основные механизмы реагирования и устойчивости2.

Наличие исследовательских инструментов, применимых к бентическим книдариям, имеет решающее значение для решения этой проблемы, и разработка этих инструментов требует активных усилий по передаче знаний и технологий, полученных в других областях, морским организмам3. Препятствия для работы со многими видами кораллов частично устраняются за счет использования модельных систем, таких как актиния Exaiptasia diaphana (обычно называемая Aiptasia)4. Эти быстрорастущие, факультативно симбиотические морские анемоны относительно легко содержатся в лабораторных условиях, размножаются как половым, так и бесполым путем, и не имеют скелета из карбоната кальция5. Референсный геном5 E. diaphana , находящийся в открытом доступе, облегчает использование эпигенетических методов, требующих секвенирования. Тем не менее, такие особенности, как высокое содержание воды, выработка слизи и низкое количество тканей на одного человека, являются проблемами для создания воспроизводимых протоколов, что ограничивает эпигенетические исследования E. diaphana и других книдариев с аналогичными особенностями.

Эпигенетические модификации могут изменять фенотип, не изменяя геномную последовательность нуклеотидов организма, регулируя процессы, связанные с хроматином6. Эпигенетическая регуляция книдариев в основном исследуется в контексте эволюционной истории и развития 7,8,9,10, установления и поддержания симбиоза 11,12,13 и реакции на изменения окружающей среды 14,15. В частности, вариации в паттернах метилирования ДНК, которые в большинстве случаев включают добавление метильной группы к основанию цитозина, наблюдались в ответ на изменение условий окружающей среды, таких как потепление13 и закисление океана16. Также было показано, что паттерны метилирования ДНК наследуются из поколения в поколение, что подчеркивает роль эпигенетики в акклиматизации кораллов к стрессовым факторам окружающей среды. По сравнению с метилированием ДНК, было проведено относительно мало исследований других важных эпигенетических регуляторов, таких как некодирующие РНК 11,18,19, факторы транскрипции 9,10 или посттрансляционные модификации гистонов (ПТМ) у книдариев20. Исследование ДНК-ассоциированных белков является особенно сложным, поскольку имеющиеся методы требуют доступа к референсному геному исследуемого организма и являются дорогостоящими из-за больших размеров выборки и необходимости высокоспецифичных антител. При большом разнообразии химических групп, которые образуют ПТМ на конкретных остатках гистонов, понимание ландшафтов модификации хроматина у книдарий, особенно в контексте надвигающихся стрессов окружающей среды, остается большой проблемой.

Целью данной работы является дальнейшее исследование гистонов PTM, вариантов гистонов и других хроматин-ассоциированных белков у книдарий путем представления оптимизированного протокола хроматин-иммунопреципитации (ChIP) для модели коралла E. diaphana (оригинальный протокол Bodega et al.21). ChIP можно сочетать с количественной ПЦР для характеристики локус-специфичных белково-ДНК-взаимодействий или с секвенированием нового поколения (NGS) для картирования этих взаимодействий по всему геному. В целом, белки и ДНК обратимо сшиты, так что представляющий интерес белок (POI) остается связанным с тем же локусом, с которым он связан in vivo. В то время как общий метод сшивки, широко используемый в модельной системе млекопитающих, обычно поддерживается на уровне 15 минут или ниже при комнатной температуре, подход к сшивке был оптимизирован таким образом, чтобы формальдегид мог более эффективно проникать через слизь, вырабатываемую E. diaphana . Затем ткань мгновенно замораживают в жидком азоте, гомогенизируют и лизируют для извлечения ядер из клеток. Потери материала на этих этапах предотвращаются за счет использования только одного буфера для лизиса, а затем непосредственного перехода к ультразвуковой обработке, которая фрагментирует хроматин на фрагменты длиной ~300.н. Эти фрагменты инкубируются с антителами, специфичными для POI, с точностью до уровня PTM. Иммунокомплекс антитело-белок-ДНК осаждается с помощью магнитных шариков, которые связываются с первичными антителами, тем самым отбирая только те сегменты ДНК, которые связаны с POI. После реверсирования поперечных связей и очистки осадка полученные сегменты ДНК могут быть использованы для количественной ПЦР или построения библиотеки ДНК для секвенирования с целью сопоставления сегментов с референсным геномом и, таким образом, идентификации локусов, с которыми связан POI. Более подробную информацию о том, что нужно учитывать на каждом этапе, можно найти в Jordán-Pla и Visa22.

Протокол

Обзор процедур представлен на рисунке 1. Данные ChIP-Seq доступны в архиве чтения последовательностей NCBI (SRA) под кодом BioProject PRJNA931730 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA931730).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Рабочий процесс по протоколу ChIP. Обзор рабочего процесса протокола ChIP, включая предполагаемую продолжительность каждого шага и дополнительные точки остановки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Коллекция животных

  1. С помощью пластикового шпателя аккуратно отделите 20 симбиотических E. diaphana (штамм CC7) с диаметром педали ~5 мм или больше от стенок аквариума и введите их пипеткой в пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оптимизировать количество актиний в зависимости от их размера и количества предполагаемых IP. Анемоны могут быть мгновенно заморожены в жидком азоте (LN2) и храниться при температуре −80 °C в течение как минимум 1 месяца перед началом ChIP. В противном случае рекомендуется действовать сразу, чтобы предотвратить оседание анемонов на стенках 15 мл пробирки.

2. Перекрестное сшивание

  1. Приготовьте 10 мл 0,5% буфера для сшивки (табл. 1).
  2. Дайте анемонам осесть на дно пробирки или покрутите их в центрифуге в течение нескольких секунд, дойдя до ~3500 x g при комнатной температуре, а затем удалите лишнюю морскую воду с помощью вакуумного насоса. Постирайте их в 1x DPBS, подвесив, а затем снимите DPBS.
  3. Перенесите анемоны в 0,5% буфер для сшивки с помощью пинцета или пластикового шпателя, чтобы избежать переноса лишнего буфера. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 1 ч.
  4. Тем временем приготовьте 10 мл 1% буфера для сшивки (табл. 1).
  5. Как и в шаге 2.2, удалите 0,5% буфер и снова наполните пробирку 1% буфером для сшивки. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все анемоны подвешены и не прилипают друг к другу, осторожно перевернув трубку.
  6. На следующий день приготовьте 10 мл буфера для гашения из запаса 2 М глицина (Таблица 1).
  7. Удалите 1% буфер для сшивания, как показано в шаге 2.2, и приостановите работу анемонов в буфере для гашения, чтобы остановить реакцию сшивания. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 20 минут.
  8. Снимите закалочный буфер, как показано в шаге 2.2, и дважды промойте анемоны в DPBS. При работе с несколькими образцами держите анемоны во взвешенном состоянии в DPBS, выполняя шаги 3.2-3.4 образец за образцом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно приостановить, заморозив образец и сохранив его при температуре −80 °C не более 1 месяца. Удалите излишки DPBS, опустошив пробирку на бумажную салфетку перед замораживанием и хранением.

Таблица 1: Решения и буферы, используемые в протоколе ChIP. Ингредиенты и их соответствующие концентрации перечислены для каждого буфера, используемого в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

3. Гомогенизация и лизис

  1. Приготовьте буфер для лизиса (Таблица 1) свежим в тот же день (2 мл на образец) и добавьте 100-кратный коктейль ингибиторов протеазы (PIC, см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 1x. Очистите фарфоровую ступку и пестик этанолом, а также начните охлаждать все инструменты с помощью LN2.
  2. Сцедите DPBS и высыпьте анемоны на бумажную салфетку, чтобы удалить как можно больше жидкости. Налейте в ступку немного LN2, а анемоны перенесите с помощью пинцета.
  3. Используя пестик, начните с осторожного разламывания ткани, а затем измельчите до тех пор, пока образец не превратится в мелкий порошок. Продолжайте доливать LN2 по мере необходимости, чтобы предотвратить размораживание.
  4. Поместите 2 мл буфера для лизиса в пробирку объемом 5 мл на льду. Соберите образец с помощью шпателя и перенесите его в буфер для лизиса, убедившись, что образец растворяется в буфере. Дайте образцу отдохнуть на льду в течение 1 минуты, а затем перемешайте путем инверсии. Повторите шаги 3.2-3.4 для всех остальных образцов, тщательно очищая все оборудование этанолом между образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сведите к минимуму потери образца.
  5. Промойте шлифовальную машину Dounce (см. Таблицу материалов) с буфером для лизиса, перенесите образец и обработайте 20-30 раз тугим пестиком.
  6. Переложите образец обратно в пробирку, промойте измельчитель тканей этанолом и дистиллированной водой и повторите шаг 3.5 для всех образцов.
  7. Инкубируйте образцы на ротаторе при ~14 об/мин и 4 °C в течение ночи.
  8. Используйте трипановый синий для проверки успешного лизиса под микроскопом (20-кратное увеличение), смешав его с 10 мкл образца в соотношении 1:1. Если краситель проникает в ядра, лизис проходит успешно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент можно приостановить, сохранив образец при температуре −80 °C в течение 2 месяцев.

4. Ультразвуковая обработка

  1. Кратковременно открутите образец в центрифуге при температуре ~2 000 x g в течение 3-5 с при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость с крышки и стенок.
  2. Пропустите лизат через иглу 25 г и шприц объемом 1 мл 10 раз, чтобы разрушить любые агрегаты.
  3. Поместите образец в ледяную баню, чтобы он оставался как можно более прохладным во время ультразвуковой обработки.
  4. Очистите ультразвуковую иглу этанолом. Поместите образец в ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов) иглой на высоте 1 см над дном пробирки и не касаясь стенок.
  5. Установите коэффициент заполнения на 50%, а на выходе — на 0. Запустите ультразвуковой аппарат и убедитесь, что в образце не образуется пена (в противном случае остановитесь и отрегулируйте положение иглы). Медленно увеличьте выходную мощность до 2, а затем обрабатывайте ультразвуком в течение 2 минут.
  6. Выключите ультразвуковой аппарат, установите выходную мощность обратно на 0 и дайте образцу отдохнуть и остыть в течение 2 минут.
  7. Повторите шаги 4.5-4.6 для получения в общей сложности четырех наборов ультразвуковой обработки и охлаждения на каждый образец. Извлеките образец, положите его на лед, а затем повторите с другими образцами. Очистите иглу ультразвукового аппарата этанолом между образцами и в конце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться оптимизация интенсивности ультразвука и количества циклов для достижения наименьшей интенсивности ультразвука при получении фрагментов размером 150-500.н.

5. Экстракция ДНК и проверка размера фрагмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем переходить к IP, необходимо проверить размер фрагментов. Если фрагменты слишком велики (>500.н.), количество циклов ультразвука и/или интенсивность ультразвука должны быть увеличены; Если они слишком малы (<150.н.), время и/или интенсивность ультразвука должны быть уменьшены.

  1. Держите образец на льду во время проверки размера фрагмента на подмножестве образца. Переложите субпопуляцию объемом 100 мкл в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Добавьте 8 мкл коктейля РНКазы (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 42 °C в течение 30 минут, встряхивая при 700 об/мин.
  3. Добавьте 2 мкл протеиназы К (см. Таблицу материалов). и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч при встряхивании при 700 об/мин.
  4. Сшивайте образец в обратном направлении, инкубируя его при температуре 95 °C в течение не менее 1 ч при встряхивании со скоростью 700 об/мин.
  5. Приготовьте 1% агарозный гель с 1x буфером TAE и 0,01% бромидом этидия (см. Таблицу материалов) или альтернативное гелевое окрашивание.
  6. Извлеките ДНК из образца с помощью набора для очистки, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
  7. Чтобы проверить размер фрагментации извлеченной ДНК, загрузите агарозный гель с помощью лестницы и образцу. Смешайте 4 мкл 1 к.. лестницы с 1 мкл 6x фиолетового красителя и поместите его в одну лунку с агарозным гелем. Смешайте 20 μL ДНК с 4 μL 6x фиолетового загрузочного красителя до конечной концентрации 1x и издайте пипетку в лунку. Повторите для всех образцов.
  8. Запустите гель при напряжении 100 В в течение примерно 30 минут, а затем визуализируйте гель, загрузив его на лоток, поместив в систему визуализации геля и следуя инструкциям программного обеспечения соответствующей системы (см. Таблицу материалов). Решите, следует ли двигаться дальше, исходя из размеров фрагментации, которые должны составлять в среднем 150-500.о. (Рисунок 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2: Проверка размера фрагмента. После ультразвуковой обработки часть образца десшивается, очищается и наносится на агарозный гель, чтобы убедиться, что хроматин был срезан до размеров фрагментов от 150 до 500.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Иммунопреципитация (ИП)

  1. С помощью пипетки проверьте объем основного образца, который держался на льду во время экстракции ДНК. Добавьте 10% Triton X-100 до конечной концентрации 1%.
  2. Вращайте образец при температуре 20 000 x g при 4 °C в течение 10 минут, а затем переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, заморозив образец при температуре −80 °C на срок до 2 месяцев. Детали следующих этапов IP необходимо будет корректировать и оптимизировать для каждого эксперимента. Возможно, потребуется оптимизировать количество антител на IP.
  3. Используя буфер для лизиса в качестве заготовки, измерьте концентрацию хроматина, следуя инструкциям доступной системы измерения концентрации ДНК (см. Таблицу материалов).
  4. В зависимости от объема образца и планируемого количества ИП увеличьте общий объем образца, добавив 10% Triton X-100 и 100x PIC (см. Таблицу материалов) до конечных концентраций 1% и 1x соответственно. Рекомендуется использовать 100 мкг хроматина в общем объеме 1 000 мкл.
  5. Распределите объем для каждого IP в отдельную пробирку объемом 1,5 мл с низким удержанием (см. Таблицу материалов). Для ChIP-qPCR поместите эквивалентный объем образца в другую пробирку объемом 1,5 мл в качестве имитации контроля. Возьмите 10% объема IP-адресов в качестве входного управления и сохраните его при температуре −20 °C.
  6. Добавьте 4 мкг антитела (в данном случае антитело H3K4me3, см. Таблицу материалов) к каждому соответствующему IP. Ничего не добавляйте к макету. Инкубируйте реакции IP и макет на вращателе трубки при 12 об/мин и при 4 °C в течение ночи.

7. Восстановление иммунокомплексов с помощью магнитных шариков

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда избегайте высыхания магнитных шариков; Держите их накрытыми жидкостью, или пополняйте растворы как можно быстрее. Всегда работайте над одним образцом за другим.

  1. Аккуратно инвертируйте магнитные шарики (см. Таблицу материалов) для перемешивания.
  2. Приготовьте 10 мл блокирующего раствора (Таблица 1) в свежем виде в день и аккуратно перемешайте.
  3. Отрежьте кончик наконечника пипетки, чтобы увеличить диаметр, и переложите 50 мкл магнитных шариков в отдельные пробирки (по одной пробирке на IP и одну для макета).
  4. Добавьте 1 мл блокирующего раствора в каждую пробирку и инкубируйте их на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 30 минут.
  5. Поместите шарики в блокирующем растворе на магнитную решетку и дождитесь отделения. Тем временем замедлите реакцию IP при 2 000 x g в течение 3-5 с при комнатной температуре, чтобы удалить любые остатки со стенок.
  6. С помощью пипетки извлеките и выбросьте надосадочную жидкость из блокирующего раствора, а затем смойте шарики со стены одним из образцов или макетом. Поместите смесь обратно в соответствующую пробирку с низким удержанием, а затем перейдите к следующему образцу.
  7. Инкубируйте все пробирки на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 3 ч.

8. Промывка, элюирование и реверсирование поперечных связей

  1. Приготовьте промывочные буферы и солевой буфер TE (табл. 1) во время инкубации восстановления иммунокомплекса.
  2. После инкубации поместите IP-адреса и макет на магнитную стойку и подождите около 10-20 с, пока магниты отделятся.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера для стирки с низким содержанием соли. Повторите со всеми реакциями, а затем снимите трубки с магнитной решетки и перемешивайте, пока бусины не станут взвешенными.
  4. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 5 минут.
  5. Поместите пробирки на магнитную решетку, удалите буфер для промывки с низким содержанием соли, затем добавьте 1 мл буфера для промывки с высоким содержанием соли и инкубируйте, как описано в шаге 8.4.
  6. Повторите шаги 8.3-8.5 еще раз в общей сложности четыре промывки с использованием попеременно низкого и высокого содержания соли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для стирки с высоким содержанием соли очень жесткий, и его следует использовать только ровно 5 минут на каждом этапе стирки.
  7. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и промойте 1 мл солевого буфера TE; Повторите еще раз. После второй промывки промойте все шарики из крышки тюбика.
  8. Сделайте элюирующий буфер (Таблица 1) во время стирки. После того, как вы отбросите вторую промывку солевого буфера TE, добавьте 210 μл элюирующего буфера в каждую реакцию.
  9. Подвесьте магнитные шарики и вытряхните при температуре 65 °C, встряхивая при 700 об/мин в течение 15 минут.
  10. Поместите реакции на магнитный штатив, соберите элюат и поместите его в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
  11. Повторите процесс элюирования с еще 210 мкл элюирующего буфера и добавьте элюат в первую партию, чтобы получить окончательный объем 420 мкл элюирования на IP, и имитируйте.
  12. Извлеките вход из морозильной камеры и добавьте элюирующий буфер до общего объема 420 μл.
  13. Обратное сшивание всех элюатов и входных данных путем их инкубации при 65 °C и 700 об/мин в течение ночи.

9. Расщепление белков и РНК и очистка ДНК

  1. Разбавьте концентрацию SDS (см. Таблицу материалов) до 0,5% путем добавления 420 мкл солевого буфера TE в элюат и вход.
  2. Для расщепления РНК добавьте 10 μL коктейля РНКазы (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 42 °C при 700 об/мин в течение 30 минут.
  3. Для переваривания белка добавьте 8 мкл протеиназы К (см. Таблицу материалов) во все и инкубируйте при 55 °C при 700 об/мин в течение 1 ч.
  4. Для очистки ДНК следуйте «Протоколу Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol» для MicroChIP»23 с некоторыми корректировками:
    1. Подготовьте пробирки с гелем с фазовой блокировкой (см. Таблицу материалов), опуская гель на дно пробирки при давлении 20 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
    2. Под вытяжной шкаф добавьте по одному образцу и такой же объем фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) в каждую пробирку. Энергично встряхните трубки и кратковременно похлопайте по ним, пока они не образуют пенистый белый слой.
      ВНИМАНИЕ: Смесь токсична, агрессивна и опасна для здоровья.
    3. Отжим в течение 10 минут при 4 °C и 20 000 x g. Убедитесь, что водная фаза чистая.
    4. Перенесите водную фазу в свежую пробирку с помощью пипетки. В зависимости от вероятного объема образца требуется две свежие пробирки на образец. В этом случае переложите половину образца из первой пробирки во вторую.
    5. Добавьте 1/10 объема в 3 М ацетата натрия (NaAc, например, 40 мкл для образца 400 мкл) и 10 мкл линейного акриламида 5 мг/мл в каждый образец и перемешайте.
    6. Добавьте в 2 раза больше объема образца в 100% этаноле (например, 800 мкл для образца 400 мкл) и энергично встряхните. Не делайте вихрей, так как это может повредить ДНК.
    7. Инкубировать при температуре −20 °C в течение ночи или при температуре −80 °C в течение 30 минут.
    8. Охладите центрифугу до 4 °C, а затем вращайте образцы в течение 30 минут при 15 000 x g , чтобы гранулировать ДНК.
    9. Тщательно сцедите и промойте гранулы 1 мл 70% EtOH. Вращайте на максимальной скорости в течение 5 минут при температуре 4 °C.
    10. Тщательно сцедите, а затем снова крутите в течение нескольких секунд. С помощью пипетки удалите весь этанол. Если остался небольшой кусочек, это может помочь повторное вращение.
    11. Ресуспендируйте гранулы в 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в образце несколько пробирок, повторно суспендируйте одну гранулу в 30 μл, переложите в следующую пробирку и повторно суспендируйте следующую гранулу в тех же 30 μл.
  5. Измерьте концентрацию ДНК, а затем храните образец при температуре −20 °C.

Результаты

В соответствии с вышеуказанным протоколом ДНК, ассоциированную с триметилированием гистона-3 лизина 4 (H3K4me3), иммунопреципитировали. Антитело класса ChIP-seq ранее использовалось на актинии Nematostella vectensis7 и было валидировано здесь путем иммунофлуоресцентного окрашивания срезов тканей E. diaphana (Рисунок 3). Хотя выход ДНК зависит от количества исходного материала, он обычно составляет около 100 нг/мкл. Полученные фрагменты ДНК анализировали методами секвенирования и количественной ПЦР (список праймеров в Дополнительном файле 1).

Глубина секвенирования в 40 миллионов прочтений дала ~17,6 миллиона уникально картированных прочтений. После проверки качества необработанные прочтения были обрезаны и сопоставлены с геномом E. diaphana с использованием Bowtie24 (см. Таблицу материалов). Модельный анализ данных ChIP-Seq с помощью MACS (см. Таблицу материалов) выявил в общей сложности 19 107пиков25. Как и ожидалось для H3K4me3, большинство пиков были расположены вблизи сайта начала транскрипции (TSS), и частота пикового количества резко снизилась по обе стороны от TSS, но особенно по направлению к телу гена (рис. 4).

По данным секвенирования были идентифицированы три гена с высокими пиками вокруг TSS, а праймеры qPCR были разработаны для нацеливания на несколько локусов высоких пиков в этих генах. Данные кПЦР нормализовали с использованием метода процентного соотношения ввода (рис. 5). Наблюдалось высокое обогащение H3K4me3 относительно входного и фиктивного управления. Процент входных данных варьировался от 2,7% до 10,7%, при этом различия в обогащении наблюдались между генами и между различными локусами в пределах одного и того же гена.

figure-results-1
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентное окрашивание H3K4me3. Тканевый срез E. diaphana окрашивали (А) синим красителем нуклеиновой кислоты Хёхста и (В) желтым меченным флуорофором вторичным антителом против первичного антитела против H3K4me3. (C) Перекрытие A и B , показывающее колокализацию в ядре. Масштабная линейка = 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 4: Высокая частота пикового подсчета вокруг сайта начала транскрипции. Распределение пиковой частоты подсчета модификации H3K4me3 в восходящем (-) и нисходящем (+) 2000.о. вокруг сайта начала транскрипции (TSS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 5: H3K4me3 ChIP-qPCR при Exaiptasia diaphana. Результаты представлены в процентах (%) от входных данных. Для проведения ChIP-qPCR были выбраны локусы, расположенные рядом с сайтом начала транскрипции соответствующих генов (AIPGENE12312, AIPGENE26042 и AIPGENE5950). Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение между репликациями, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Список праймеров, используемых для количественной ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Следуя вышеуказанному протоколу, полученная ДНК была успешно использована для проведения ChIP-qPCR и ChIP-Seq. Здесь был получен тот же общий профиль пика H3K4me3, о котором ранее сообщалось у других организмов 26,27,28, с самым высоким пиком вокруг TSS и высоким обогащением в ожидаемых участках в ChIP-qPCR. Относительно большое количество многократно картированных прочтений в данных ChIP-Seq могло быть вызвано дубликатами ПЦР. Количество уникально картированных прочтений может быть увеличено за счет изменений в протоколе подготовки библиотеки ДНК для уменьшения количества дубликатов ПЦР. Существует несколько методов нормализации данных ChIP-qPCR, при этом чаще всего используется метод процентного ввода, представленный здесь. Этот метод нормализует IP и фиктивные сэмплы непосредственно на вход, с тем недостатком, что вход обрабатывается иначе, чем IP и фиктивные сэмплы во время ChIP, что может привести к ошибкам. Метод альтернативного кратного обогащения нормализует сигнал IP на основе сигнала макета с использованием тех же наборов праймеров, что дает соотношение сигнал к фону. Однако интенсивность сигнала фиктивной выборки может сильно варьироваться, что, в свою очередь, оказывает большое влияние на данные. Подробное обсуждение ChIP-qPCR и нормализации данных можно найти в Haring et al.29.

Основным изменением в представленном выше методе по сравнению с распространенными протоколами ChIP является гораздо более длительное время сшивки, от примерно 15 минут для белков гистонов до ночной инкубации. Основной целью этой корректировки является облегчение проникновения фиксирующего формальдегида через слой слизи в более глубокие ткани E. diaphana для сохранения белок-ДНК-взаимодействий внутри ядра. Оптимизация этого шага имеет решающее значение для обеспечения достаточного сшивания для сохранения взаимодействий белка и ДНК без сшивки настолько, что сдвиг хроматина с помощью ультразвука становится неэффективным. Добавление моющих средств, таких как SDS, также может повысить эффективность ультразвука29. Кроме того, было обнаружено, что длительная инкубация с формальдегидом облегчает стадию гомогенизации и приводит к получению более мелкого и равномерного измельчения образца по сравнению со свежими или замороженными анемонами, которые были гомогенизированы до стадии сшивки. Рекомендуемые диапазоны длин фрагментов варьируются от 100.о. до 1000.н.29,30 и могут зависеть от белка-мишени. Крайне важно, чтобы каждый пользователь оптимизировал условия ультразвуковой обработки для достижения желаемой длины фрагмента с как можно меньшей мощностью ультразвука, поскольку чрезмерная ультразвуковая обработка может денатурировать белки и, таким образом, повлиять на IP31. Еще одним ограничением ChIP является количество необходимого материала, который особенно влияет на относительно мелкие организмы, такие как анемоны; Проблема устранена путем уменьшения потерь образца между этапами. После гомогенизации образец был немедленно лизирован, тем самым пропустив несколько общих этапов подготовки ядер. Пул образцов, полученных из 20 анемонов, в целом содержал достаточно хроматина для трех IP, а также для имитационного и входного контроля. Количество исходного материала (т.е. количество анемонов) может быть еще больше уменьшено в будущем, особенно при выполнении ChIP только с одним белком-мишенью. В зависимости от предполагаемого метода последующего потока, органы управления должны быть отрегулированы; для ChIP-qPCR следует рассмотреть возможность включения дополнительных элементов управления29, в то время как для ChIP-seq макет может быть опущен в пользу входного контроля.

Несмотря на то, что валидация антител выходит за рамки данного протокола и, таким образом, была лишь кратко затронута здесь, это критически важный шаг перед выполнением ChIP. Особенно при использовании коммерческих антител на беспозвоночных видах доступность специфических антител для желаемых мишеней может быть ограничением. На первом этапе была сравнена последовательность N-концевого хвоста H3 E. diaphana и других модельных организмов, включая рыбок данио и мышей, и было обнаружено, что онавысоко консервативна. Затем специфичность антител была проверена с помощью иммунофлуоресценции, которая колокализовала сигналы нуклеиновой кислоты и антитела. Пиковый профиль H3K4me3 вокруг TSS, полученный по данным секвенирования, дает дополнительную уверенность в отношении специфичности антитела.

Еще одним соображением, касающимся специфичности антител, является возможность какого-либо взаимодействия с симбиотическими динофлагеллятами, которые E. diaphana, как и многие другие антозойные, содержат в своих клетках. Транскриптомный анализ динофлагеллятов родов Lingulodinium32 и Symbiodinium33 обнаружил гены, кодирующие гистоны, в том числе основной гистон H3 и несколько вариантов H3 с низким уровнем экспрессии, а степень функциональной сохранности кода гистонанеясна. Marinov and Lynch34 сравнили сохранение последовательности N-концевых хвостов варианта H3 внутри и между видами динофлагеллятов, и виды Symbiodiniaceae показали высокую дивергенцию вокруг лизина 4 в последовательности хвоста, особенно при рассмотрении конгруэнтности соседних аминокислот с лизином 4 в качестве фактора. Также было показано, что этот регион отличается от других модельных видов, таких как Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster и Saccharomyces cerevisiae, которые соответствуют последовательности E. diaphana12. Таким образом, риск непреднамеренного взаимодействия антитела против H3K4me3 с динофлагеллятом H3 низок. Кроме того, последовательности выравниваются только по геному E. diaphana , а праймеры количественной ПЦР должны быть специфичны для последовательностей E. diaphana , обеспечивая дополнительный слой фильтрации любых непреднамеренно осажденных последовательностей.

Представленный протокол ChIP дает достаточное количество ДНК для количественной ПЦР, а также для секвенирования следующего поколения, и, хотя вероятно, потребуется индивидуальная оптимизация каждым пользователем, он обеспечивает отправную точку для более интенсивного исследования белок-ДНК-взаимодействий у бентосных книдарий, возможно, в контексте симбиоза и изменений окружающей среды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 kb Plus DNA LadderInvitrogen10787018
100% этанол
15 мл пробирки
16% раствор формальдегида (w/v), без метанолаThermo scientific28906
5 мл пробирки
5PRIME Phase Lock TubesQuantabio2302820Phase lock гель - легкая
игла AGANI 25 GTerumoAN*2516R1
Agarose
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7030
Бабочкас открытым исходным кодом, доступно в https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
сонификатор Branson 250BransonSonicator 
Центрифуга Eppendorf5430 RС роторами для пробирок 15 мл и 1,5 мл
Антитело класса ChIP (в данном случае поликлональное антитело H3K4me3)ДиагенодC15410003
Полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche118735800012 таблетки/мл воды для 100x сток
Крышное стеклоvwr48393 194
Одноразовый шпательvwr80081-188
Набор для очистки ДНК (здесь QIAGEN QIAquick набор для очистки ПЦР)QIAGEN28104
Dounce тканевый измельчительWheatonтугой пестик
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (DPBS) 1xgibco14190-094
Dynabeads ProteinG Thermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-Aldrich3609
EGTASigma-Aldrich324626
электрофореза
Бромид
FASTQC v0.11.9программное обеспечение
Gel Doc EZ Система документацииBio-Rad1708270Система визуализации геля
ГлицинSigma-Aldrich50046
Injekt-F Туберкулиновый шприц 1 млB. Braun9166017V
Линейный акриламид (5 мг/мл)InvitrogenAM9520
Пробирка
Магнитная разделительная стойкадля пробирок 1,5 мл
Предметное стекло
Модельный анализ ChIP-Seq (MACS)открытым исходным кодом
Ступка и пестик, фарфор
NanoDrop 2000c спектрофотометрThermo scientific ND-2000C
N-лауроилсаркозинSigma-Aldrich61739
Безнуклеаза для воды
Пастеровская пипетка
Фенол:Хлороформ:Изоамиловая спиртовая смесь (25:24:1)Sigma-Aldrich77617
Протеиназа К (20 мг/мл)AmbionAM2546
Фиолетовый краитель для загрузки 6xNew England BioLabsB7024S
Qubit 2.0 ФлуориметрИнвитроген
РНКаза Коктейль Смесь ферментовИнвитрогенAM2286РНКаза А = 500 Ед/мл, РНКаза Т1 = 20000 Ед/мл
Ацетат натрияСигма-ОлдричS2889
Хлорид натрияСигма-ОлдричS9888
Дезоксихолат натрияСигма-Олдрич30970
SYBR Safe DNA Гель МорилкаInvitrogenS33102
TAE буферный
термомиксерEppendorf5384000012
Трис основаSigma-Aldrich10708976001
Тритон X-100 растворSigma-Aldrich93443
Трипан Синий Краситель (0.4%)Gibco15250-061Опасность: может вызвать рак. При подозрении на нарушение фертильности или у будущего ребенка
Трубчатый ротатор SB3Stuart
UltraPure SDS Solution, 10%Invitrogen15553027
Вакуумный насос
для соколаСистема этидия1,5 мл с низким удержанием для микроскопа с

Ссылки

  1. Pörtner, H. -O. 2022: Summary for Policymakers. Climate Change 2022: Impacts, Adaptation, and Vulnerability. Contribution of Working Group II to the Sixth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2022).
  2. Cziesielski, M. J., Schmidt-Roach, S., Aranda, M. The past, present, and future of coral heat stress studies. Ecology and Evolution. 9 (17), 10055-10066 (2019).
  3. Eirin-Lopez, J., Putnam, H. Marine environmental epigenetics. Annual Review of Marine Science. 11, 335-368 (2021).
  4. Rädecker, N. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9 (214), (2018).
  5. Baumgarten, S. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. PNAS. 112 (38), 11893-11898 (2015).
  6. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  7. Schwaiger, M. Evolutionary conservation of the eumetazoan gene regulatory landscape. Genome Research. 24 (4), 639-650 (2014).
  8. Zhang, X., Jacobs, D. A broad survey of gene body and repeat methylation in cnidaria reveals a complex evolutionary history. Genome Biology and Evolution. 14 (2), evab284(2022).
  9. Schwaiger, M. An ancestral Wnt-Brachyury feedback loop in axial patterning and recruitment of mesoderm-determining target genes. Nature Ecology & Evolution. 6 (12), 1921-1939 (2022).
  10. Ozment, E., et al. Cnidarian hair cell development illuminates an ancient role for the class IV POU transcription factor in defining mechanoreceptor identity. Elife. 10, e74336(2021).
  11. Baumgarten, S., et al. Evidence for miRNA-mediated modulation of the host transcriptome in cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Molecular Ecology. 27 (2), 403-418 (2018).
  12. Li, Y. DNA methylation regulates transcriptional homeostasis of algal endosymbiosis in the coral model Aiptasia. Science Advances. 4 (8), eaat2142(2018).
  13. Rodriguez-Casariego, J. A., Cunning, R., Baker, A. C., Eirin-Lopez, J. M. Symbiont shuffling induces differential DNA methylation responses to thermal stress in the coral Montastraea cavernosa. Molecular Ecology. 31 (2), 588-602 (2021).
  14. Putnam, H. M., Davidson, J. M., Gates, R. D. Ocean acidification influences host DNA methylation and phenotypic plasticity in environmentally susceptible corals. Evolutionary Applications. 9 (9), 1165-1178 (2016).
  15. Weizman, E., Levy, O. The role of chromatin dynamics under global warming response in the symbiotic coral model Aiptasia. Communications Biology. 2, 282(2019).
  16. Liew, Y. J. Epigenome-associated phenotypic acclimatization to ocean acidification in a reef-building coral. Science Advances. 4 (6), eaar8028(2018).
  17. Liew, Y. J. Intergenerational epigenetic inheritance in reef-building corals. Nature Climate Change. 10 (3), 254-259 (2020).
  18. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), e91101(2014).
  19. Huang, C., et al. Identification of long non-coding RNAs in two anthozoan species and their possible implications for coral bleaching. Scientific Reports. 7, 5333(2017).
  20. Rodriguez-Casariego, J. A., et al. Coral epigenetic responses to nutrient stress: Histone H2A.X phosphorylation dynamics and DNA methylation in the staghorn coral Acropora cervicornis. Ecology and Evolution. 8 (23), 12193-12207 (2018).
  21. Bodega, B., et al. A cytosolic Ezh1 isoform modulates a PRC2-Ezh1 epigenetic adaptive response in postmitotic cells. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 444-452 (2017).
  22. Jordán-Pla, A., Visa, N. Considerations on experimental design and data analysis of chromatin immunoprecipitation experiments. Chromatin Immunoprecipitation., edited by Visa, N., Jordán-Pla, A. Visa, N., Jordán-Pla, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-28 (2017).
  23. ENCODE. Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP. , Stanford University. Available from: https://www.encodeproject.org/documents/ (2023).
  24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, R25(2009).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nature Protocols. 7, 1728-1740 (2012).
  26. Howe, F. S., Fischl, H., Murray, S. C., Mellor, J. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. BioEssays. 39 (1), e201600095(2017).
  27. Zhang, Z., Shi, L., Dawany, N., Kelsen, J., Petri, M. A., Sullivan, K. E. H3K4 tri-methylation breadth at transcription start sites impacts the transcriptome of systemic lupus erythematosus. Clinical Epigenetics. 8, 14(2016).
  28. Li, X. High-resolution mapping of epigenetic modifications of the rice genome uncovers interplay between DNA methylation, histone methylation, and gene expression. The Plant Cell. 20, 2-276 (2008).
  29. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2014).
  30. Landt, S. G. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  31. Raha, D., Hong, M., Snyder, M. ChIP-Seq: A method for global identification of regulatory elements in the genome. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, Unit 21.19.1-Unit 21.19.14 (2010).
  32. Roy, S., Morse, D. A full suite of histone and histone modifying genes are transcribed in the dinoflagellate Lingulodinium. PLoS One. 7 (4), e34340(2012).
  33. Bayer, T., et al. Symbiodinium transcriptomes: Genome insights into the dinoflagellate symbionts of reef-building corals. PLoS One. 7 (4), e35269(2012).
  34. Marinov, G. K., Lynch, M. Diversity and divergence of dinoflagellate histone proteins. G3 Genes, Genomes, Genetics. 6 (2), 397-422 (2016).

Перепечатки и разрешения

Теги

ChIP-Seqэпигенетика стрекающихмодификации гистоновбелок-ДНК взаимодействиятриметилирование H3K4количественная ПЦРэкстракция хроматинаиммунофлуоресцентное окрашивание
Иммунопреципитация хроматина в модельной системе Книдария Exaiptasia diaphana
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.