Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Описан протокол для выполнения живой визуализации в режиме реального времени для количественной оценки того, как вспомогательный белок TnpB влияет на динамику транспозиции в отдельных живых клетках кишечной палочки .

Abstract

Здесь описан протокол для выполнения живой визуализации в режиме реального времени транспонируемой активности элементов в живых бактериальных клетках с использованием набора флуоресцентных репортеров, связанных с транспозицией. В частности, он демонстрирует, как визуализация в реальном времени может быть использована для оценки влияния дополнительного белка TnpB на активность транспонируемого элемента IS608, члена семейства транспонируемых элементов IS200/IS605. Семейство транспонируемых элементов IS200/IS605 представляет собой множество подвижных элементов, связанных с одним из самых бесчисленных генов, обнаруженных в природе, tnpB. Гомологии последовательностей предполагают, что белок TnpB может быть эволюционным предшественником систем CRISPR/Cas9. Кроме того, TnpB получил новый интерес, поскольку было показано, что он действует как эндонуклеаза ДНК, управляемая Cas-РНК. Влияние TnpB на скорость транспозиции IS608 количественно определено, и показано, что экспрессия TnpB IS608 приводит к увеличению транспозонной активности в ~5 раз по сравнению с клетками, в которых отсутствует экспрессия TnpB.

Introduction

Транспонируемые элементы (ТЭ) являются генетическими элементами, которые мобилизуются в геномах своих хозяев путем иссечения или катализируют копирование с последующей геномной реинтеграцией. ТЭ существуют во всех областях жизни, и транспозиция реструктурирует геном хозяина, мутируя кодирующие и управляющие области¹. Это порождает мутации и разнообразие, которые играют важную роль в эволюции ^2,3, развитии ^4,5 и нескольких заболеваниях человека⁶, включая рак⁷.

Используя новые генетические конструкции, которые связывают аспекты транспозиционной активности с флуоресцентными репортерами, наша предыдущая работа описывала разработку экспериментальной системы на основе бактериального TE IS608, представителя широко распространенного семейства ТЭ IS200/IS605 , которое позволяет в режиме реального времени визуализировать транспозицию в отдельных живых клетках⁸ (рисунок 1). Система TE показана на рисунке 1A. TE содержит транспозазную кодирующую последовательность tnpA, окруженную несовершенными палиндромными повторами (IP) левого конца (LE) и правого конца (RE), которые являются сайтами распознавания и иссечения для TnpA. tnpA экспрессируют с помощью промотора P_LTetO1, который подавляется тет-репрессором и индуцируется ангидротетрациклином (aTc)⁹. TE разделяет последовательности -10 и -35 конститутивного промотора P_lacIQ1 ¹⁰ для синего репортера mCerulean3¹¹. Как показано на рисунке 1С, при индуцировании производства tnpA ТЭ может быть иссечен, что приводит к восстановлению промотора. Продуцируемая клетка экспрессирует mCerulean3 и флуоресцес синего цвета. N-конец TnpA слит с желтым репортером Venus¹², что позволяет измерять уровни TnpA с помощью желтой флуоресценции.

IS608 и другие члены семейства транспозонов IS200/IS605 также обычно кодируют второй ген до сих пор неизвестной функции, tnpB¹³. Белки TnpB представляют собой чрезвычайно обильное, но несовершенное семейство нуклеаз, кодируемых несколькими бактериальными и архейными TEs^14,15, которые часто состоят только из tnpB¹⁶. Кроме того, недавние исследования возобновили интерес к TnpB, обнаружив, что TnpB функционирует как CRISPR/Cas-подобная программируемая РНК-управляемая эндонуклеаза, которая будет давать либо dsDNA, либо ssDNA разрывы в различных условиях^17,18. Однако остается неясным, какую роль TnpB может играть в регулировании транспозиции. Для выполнения визуализации в реальном времени эффектов TnpB на транспозицию IS608 была создана версия транспозона, включающая кодирующую область TnpB с N-концевым слиянием с красным флуоресцентным белком mCherry.

В дополнение к более подробным объемным исследованиям, выполненным лабораторией Кульмана¹⁹, здесь показано, как визуализация транспозонной активности в режиме реального времени может количественно выявить влияние TnpB или любых других вспомогательных белков на транспозициональную динамику. При слиянии TnpB с mCherry отдельные транспозиционные события идентифицируются синей флуоресценцией и коррелируют с уровнями экспрессии TnpA (желтая флуоресценция) и TnpB (красная флуоресценция).

Protocol

1. Подготовка бактериальных культур

1. Вырастите штамм E. coli MG1655 с плазмидными транспозонными конструкциями (ранее описанными в Kim et ^al.8) в течение ночи в LB с соответствующими антибиотиками (25 мкг/мл канамицина, см. Таблицу материалов) при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности используемых конструкций и связанные с ними последовательности доступны в виде номеров присоединения GenBank²⁰ OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 и OP717085.
2. Для достижения устойчивого экспоненциального роста разбавляют культуры ≥100 раз в среду M63 (100 мМ KH₂PO₄, 1 мМ MgSO₄, 1,8 мкМ FeSO₄, 15 мМ [NH₄]₂SO₄, 0,5 мкг/мл тиамина [витамина B1]), дополненного источником углерода (0,5% мас./об.глюкозы здесь) и соответствующими антибиотиками (см. Таблицу материалов).
3. Выращивайте культуры при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм (OD600) не достигнет ~0,2. Культуры готовы к использованию.

2. Подготовка слайдов

1. Приготовьте слайд, вскипятив M63 с 0,5% мас./об. глюкозы и 1,5% мас./v агарозы в микроволновой печи, чтобы расплавить агарозу и убедиться, что она полностью расплавлена и хорошо перемешана.
2. Дайте смеси остыть до ~55 °C перед добавлением антибиотиков и индукторов (25 мкг/мл канамицина и 10 нг/мкл ангидротетрациклина [aTc], см. Таблицу материалов).
3. Поместите предметное стекло микроскопа на верстак. Сложите еще два слайда перпендикулярно первому и поместите еще один сверху, параллельно нижнему слайду. Убедитесь, что между нижним и верхним слайдами имеется зазор, равный одной толщине затвора. Пипетка ~ 1 мл смеси агарозы M63 в этот зазор между слайдами медленно создает небольшой гель-квадрат.
4. Как только гель затвердеет (~10-15 мин), сдвиньте верхний слайд, чтобы удалить его. Обрежьте подушечку агарозы лезвием бритвы или ножом. Затем пипетку 2,5 мкл культуры (шаг 1.3) и сверху кладут крышку.
5. Запечатайте пространство между слайдом и крышкой с помощью эпоксидной смолы (см. Таблицу материалов). Дайте эпоксидной смоле высохнуть, и ячейки осядут на агарозной подушке в течение не менее 1 ч при 37 °C.

3. Таймлапс флуоресцентная микроскопия

1. Поместите подготовленный образец (этап 1.3) на флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов) в среду, нагретую и поддерживаемую при температуре 37 °C.
   1. Установите время экспозиции, соответствующее камере, используемой для получения изображения. Отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовалось время экспозиции 2 с для каждой длины волны.
   2. Для каждой длины волны найдите поле зрения (FOV), содержащее минимальную флуоресценцию. Получение изображений для использования во время анализа для вычитания фона.
2. Настройте протокол для получения изображений в сетке на разных длинах волн и через регулярные промежутки времени.
   1. Закодируйте таймлапс-фотографию в протокол. Установите частоту сбора на желаемый интервал времени (здесь 20 мин), а общую продолжительность таймлапса на нужную длину (24 ч).
   2. Закодируйте соответствующие длины волн в протоколе (в зависимости от используемой конструкции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пик возбуждения mCherry составляет 587 нм, а пик излучения – 610 нм²¹; mVenus находится на 515 нм и 527 нм¹², в то время как mCerulean3 на 433 нм и 475 нм^{на 11}.
   3. Установите размер сетки для захвата между требуемым количеством FOV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В репрезентативных данных, показанных здесь, использовались 8 x 8 FOV.

4. Анализ изображений

1. Выполните вычитание фона на каждом цветовом канале, используя соответствующие фоновые изображения, полученные на шаге 3.1.2. Для всех этапов анализа мы используем стандартные модули в платформе с открытым исходным кодом Fiji²² (см. Таблицу материалов).
2. Аппроксимируйте общую популяцию в каждый момент времени, установив пороговое значение канала mCerulean и разделив пороговую площадь на среднюю площадь ячейки.
3. Чтобы подсчитать уникальные события иссечения, возьмите производную по времени канала mCerulean3. Выполните это, вычитая последовательные изображения в канале mCerulean3. События иссечения будут обнаружены во временной производной как яркая вспышка флуоресценции.
   1. Пороговое значение стека событий иссечения для устранения нежелательной флуоресценции. Обратите внимание, что этот процесс приведет к выходу из самих частей иссечений. Чтобы исправить это, расширьте изображения, чтобы восстановить иссечения до их первоначальных размеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ с использованием аналогичных методов порогового значения и анализа изображений может быть выполнен и на других флуоресцентных каналах (например, коррелируют события иссечения с уровнями транспозазы TnpA [желтая флуоресценция Венеры] и TnpB [красная флуоресценция вишни).

Representative Results

Discussion

Уникальный метод, представленный здесь для визуализации транспонируемой активности элементов в живых клетках в режиме реального времени, представляет собой чувствительный анализ, который может непосредственно обнаруживать транспозицию в живых клетках и в режиме реального времени и коррелировать эту активность с экспрессией вспомогательных белков. Хотя пропускная способность ниже, чем может быть достигнута объемными методами, этот метод позволяет достичь подробных измерений активности ТЭ и экспрессии белка в отдельных живых клетках.

Различные инструменты и методы могут быть использованы для выращивания клеток непосредственно на микроскопе для визуализации в режиме реального времени. Используемый здесь метод роста клеток на агарозных подушечках имеет то преимущество, что он быстрый, дешевый и простой в исполнении. Возможный недостаток, в зависимости от состояния клеточного роста, заключается в том, что ресурсы, доступные для поддержки роста клеток в агарозной подушке, ограничены, и, следовательно, клетки естественным образом исчерпают эти ресурсы и перестанут расти через относительно короткий период времени (12-24 ч). Следовательно, необходимо позаботиться о том, чтобы подготовить клетки к устойчивому росту и привить прокладку при достаточно низкой плотности, чтобы дать достаточно времени для измерения. Микрофлюидика может быть использована для поддержания клеток в устойчивом состоянии экспоненциального роста в течение длительных периодов времени²⁴, хотя эти методы требуют дополнительных знаний, оборудования и настройки, чтобы быть эффективными.

В дополнение к более подробной работе лаборатории Кульмана¹⁹ здесь проиллюстрировано, что связанный с семейством IS200/IS605 TE белок TnpB увеличивает скорость иссечения IS608 до пяти раз, и что увеличение иссечения напрямую коррелирует с более высокими уровнями экспрессии TnpB. Эти методы являются одним из примеров улучшенных методов анализа, которые могут помочь пролить свет на транспозонную активность и ее влияние на мутационную и эволюционную динамику.

Materials

2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2 
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B 
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M