Здесь внутрибрюшинная инъекция лейкозных клеток используется для установления и распространения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у мышей. Этот новый метод эффективен при серийной трансплантации клеток ОМЛ и может служить альтернативой для тех, кто может испытывать трудности и несоответствия при внутривенном введении мышам.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Внутрибрюшинная трансплантация при возникновении острого миелоидного лейкоза у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Существует неудовлетворенная потребность в новых методах лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и связанного с ним рецидива, связанного с персистирующими лейкозными стволовыми клетками (LSC). Экспериментальная модель грызунов AML для тестирования терапии, основанной на успешной трансплантации этих клеток с помощью ретроорбитальных инъекций мышам-реципиентам, сопряжена с проблемами. Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать простой, надежный и последовательный метод создания надежной мышиной модели ОМЛ с использованием внутрибрюшинного пути. В настоящем протоколе клетки костного мозга трансдуцировали ретровирусом, экспрессирующим слитый онкопротеин MLL-AF9 человека. Была проверена эффективность отрицательных (Lin-) и Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) популяций в качестве донорских LSC в развитии первичного ОМЛ, и внутрибрюшинная инъекция была принята в качестве нового метода генерации ОМЛ. Сравнение между внутрибрюшинными и ретроорбитальными инъекциями проводилось при серийных трансплантациях, чтобы сравнить и сопоставить эти два метода. Клетки Lin- и LSK, трансдуцированные вирусом MLL-AF9 человека, хорошо приживались в костном мозге и селезенке реципиентов, что приводило к полномасштабному ОМЛ. Внутрибрюшинная инъекция донорских клеток установила ОМЛ у реципиентов при серийной трансплантации, а инфильтрация клеток ОМЛ была обнаружена в крови, костном мозге, селезенке и печени реципиентов с помощью проточной цитометрии, кПЦР и гистологических анализов. Таким образом, внутрибрюшинная инъекция является эффективным методом индукции ОМЛ с использованием серийной трансплантации донорских лейкозных клеток.
Введение
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) – это разновидность гематологических злокачественных новообразований различной этиологии с неблагоприятнымпрогнозом1. Генерация моделей животных ОМЛ закладывает основу для понимания его сложных вариаций и патобиологии в попытке открыть новые методы лечения2. Лейкемогенез у мышей включает трансплантацию донорских клеток, экспрессирующих слитые онкопротеины, включая слияния с участием гена лейкемии смешанной линии (MLL) для мощной индукции ОМЛ, чтобы имитировать заболевание у людей3. Сообщалось о различном клеточном происхождении донорских клеток при трансплантации AML....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты были предварительно одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Пенсильвания.
1. Приготовление буферов и реагентов
- Приготовьте ампициллин с добавлением (AP) LB агаровые пластины (стерильные 10-сантиметровые пластины). Для этого 10 г отвара ЛБ с агаром растворяют в 400 мл дистиллированной воды, перемешивают, доводят объем до 500 мл. Стерилизуйте раствор автоклавированием, затем дайте раствору остыть, добавьте 0,5 мл ампициллина (запас: 150 мг / мл) в раствор и встряхните его, чтобы перемешать. Немедленно добавьте 18 мл раствора в стерильную 10-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сравнение эффективности трансплантации мышиных ОМЛ-клеток с использованием р.о. и в/путей трансплантации
Ранее сообщалось об установлении 1° AML у мышей-реципиентов, которым ретроорбитально трансплантировали клетки LSK, трансдуцированные MLL-AF9, а трансплантируемость клеток 1° AML была продемонстрирована серийной трансплантацией30. Настоящее исследование является первым, в котором оценивается возможность использования лин-клеток костного мозга для проведения транспл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эти вышеописанные исследования предоставляют подтверждающие доказательства того, что трансплантация Lin-клеток сопоставима с клетками LSK при генерации 1° мышиного ОМЛ. Кроме того, текущие данные также показывают, что внутривенная инъекция является эффективным и удобным методом установления ОМЛ у мышей по сравнению с внутривенной (или р.о.) инъекцией.
В дополнение к клеткам LSK, сообщалось, что другие популяции, такие как гранулоцитарно-моноцитарный предшественник (GMP), общий лимфо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Центр проточной цитометрии Института Гека и Центр гистопатологии Лаборатории диагностики животных Департамента ветеринарных и биомедицинских наук Университета штата Пенсильвания за своевременную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами Американского института исследований рака (KSP), Колледжа сельскохозяйственных наук штата Пенсильвания, Института рака штата Пенсильвания, проекта USDA-NIFA 4771, номер присоединения 00000005 к K.S.P. и R.F.P.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| a-Выберите компетентные ячейки | Bioline | BIO-85027 | |
| Хлорид аммония (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ампициллин | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA), фракция V— Биопродукты с низким содержанием эндотоксина | Gemini | Cat# 700-102P | |
| Ципрофлоксацин HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, высокий уровень глюкозы, без глутамина | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, динатриевая соль (EDTA-2Na), дигидрат, молекулярная биология | Grade Calbiochem | Cat# 324503 | |
| фетальная бычья сыворотка - Premium Select Atlanta | Biologicals | Cat# S11550 | |
| Голотрансферрин, бычий | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Раствор инсулина человеческий | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-глутамин 200 мМ (100×) раствор | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB бульон, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Бульон с агаром (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Мышь антимышиный CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Мышиный интерлейкин-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Мышиный интерлейкин-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Мышиный стволовой клеточный фактор (SCF) | Gemini био-продукт Cat | # 300-348P | |
| Раствор пенициллин-стрептомицина, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) клетки | ATCC | CRL-3214 | |
| Бикарбонат калия (KHCO3), гранулированный | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Крысиный антимышиный CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| рекомбинантный мышиный Flt3-лиганд | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| Рекомбинантный рекомбинантный фрагмент фибронектина человека | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Реагент | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI | Реактив Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Раствор трипана синего, 0,4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Меркаптоэтанол (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Набор для выделения гемопоэтических клеток-предшественников мыши | Технологии стволовых клеток | Cat# 19856A | |
| Набор для обратной транскрипции кДНК с высокой пропускной способностью | Термо Фишер | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J мыши& НБСП; | Лабораторный штамм Джексона | # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J мыши | Лабораторный | штамм Джексона # 000664 | |
| Инструменты и программное обеспечение | |||
| Adobe illustrator | Версия 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 проточный цитометр | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys программа | Версия 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism версия 6 | ГрафПад | ||
| Хемашет 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Система ПЦР в реальном времени | Прикладные биосистемы | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Хемилюминесценция Флуоресцентная визуализация G | :Box Chemi |
Ссылки
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
