В этом протоколе представлено использование CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) в адипоцитах (AdipoSPH) в качестве альтернативной стратегии аденоассоциированному вирусу (AAV) для исследования биологии бежевого жира. Инъекция in vivo несущей AAV сгРНК, нацеленной на эндогенный ген Prdm16, достаточна для того, чтобы индуцировать развитие бежевого жира и усилить программу термогенных генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование биологии и метаболизма бежевого жира с использованием системы активации CRISPR SunTag-p65-HSF1
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) вызвала революцию в биологии, и последние инструменты были применены далеко за пределами первоначально описанного редактирования генов. Система активации CRISPR (CRISPRa) сочетает в себе каталитически неактивный белок Cas9 (dCas9) с различными модулями транскрипции, чтобы индуцировать экспрессию эндогенных генов. SunTag-p65-HSF1 (SPH) — это недавно разработанная технология CRISPRa, которая сочетает в себе компоненты синергетических медиаторов активации (SAM) с активаторами SunTag. Эта система обеспечивает сверхэкспрессию одного или нескольких генов путем разработки индивидуальной однонаправляющей РНК (сгРНК). В этом исследовании ранее разработанная мышь SPH была использована для создания условной мыши, экспрессирующей SPH в адипоцитах (линия адипонектина Cre), названной AdipoSPH. Чтобы индуцировать фенотип жира от белого до бежевого (потемнение), аденоассоциированный вирус (AAV), несущий sgРНК, нацеленный на эндогенный ген Prdm16 (хорошо известный фактор транскрипции, связанный с развитием коричневого и бежевого жира), вводили в паховую белую жировую ткань (iWAT). Эта мышиная модель индуцировала экспрессию эндогенного Prdm16 и активировала термогенную генную программу. Кроме того, in vitro SPH-индуцированная сверхэкспрессия Prdm16 увеличивала потребление кислорода бежевыми адипоцитами, фенокопируя результаты предыдущей модели трансгенной мыши Prdm16. Таким образом, этот протокол описывает универсальную, экономичную и эффективную по времени модель мыши для исследования биологии жировой ткани.
Введение
Бежевые (или бритовые) адипоциты представляют собой разъединяющие адипоциты, экспрессирующие белок 1 (UCP1), и богатые митохондриями адипоциты, которые находятся в депо белой жировой ткани (WAT). Бежевый жир появляется из подмножества предшественников адипоцитов или зрелых белых адипоцитов в ответ на воздействие холода и других раздражителей 1,2. Бежевые адипоциты могут преобразовывать энергию в тепло UCP1-зависимым или независимым образом3. Независимо от своей термогенной функции, бежевый жир также может улучшить метаболическое здоровье другими средствами, такими как секреция адипокино....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследования на животных проводились в соответствии с Руководством Университета Кампинаса по уходу и использованию лабораторных животных (протокол CEUA #5810-1/2021).
1. Молекулярное клонирование
- Проектирование однонаправляющих РНК (сгРНК)
- Разрабатывайте сгРНК для активации CRISPR с помощью CHOPCHOP, доступного по адресу https://chopchop.cbu.uib.no/, или любого другого подходящего инструмента. Используйте следующие параметры для разработки sgRNA, нацеленной на ген Prdm16: Цель: Prdm16; В: Mus musculus; Использование: Crispr/Cas9; Для: Активация.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разработка сгРНК для каждого интересующего реги....
- Разрабатывайте сгРНК для активации CRISPR с помощью CHOPCHOP, доступного по адресу https://chopchop.cbu.uib.no/, или любого другого подходящего инструмента. Используйте следующие параметры для разработки sgRNA, нацеленной на ген Prdm16: Цель: Prdm16; В: Mus musculus; Использование: Crispr/Cas9; Для: Активация.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мыши AdipoSPH были выведены путем разведения штаммов мышей SPH и Adipoq-Cre. Оба штамма мышей находились на гибридном фоне C57BL6J-DBA/2J (по данным коммерческого поставщика; см. Таблицу материалов). Линия мышей SPH была первоначально описана Zhou et al.14.
Развитие бежевых адипоцитов in vivo за счет сверхэкспрессии Prdm16, опосредованной AdipoSPH
Чтобы оценить способность модели, описанной в этом исследован.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одним из наиболее полезных нередактируемых применений технологии CRISPR является опрос функции генов путем активации эндогенных генов с использованием систем CRISPRa6. SPH — это мощный CRISPRa, который первоначально был описан как индуцирующий превращение астроцитов в активные нейроны путем нацеливания на несколько нейрогенных генов14. В этом исследовании было продемонстрировано, что AdipoSPH является подходящим инструментом для изучения биологии бежевого жира путем активац.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Авторы благодарят за поддержку, полученную от Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp для создания мышей AdipoSPH, Лаборатории инммунометаболизма и клеточной сигнализации и Национального института науки и технологий по фотонике, применяемой к клеточной биологии (INFABIC) за всю экспериментальную поддержку. Мы благодарим Исследовательский фонд Сан-Паулу (FAPESP) за финансовую поддержку: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3,3',5-трийодо-L-тиронин | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-изобутил-1-метилксантин | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T клеточная линия | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra центробежный фильтр | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| дексаметазон | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Модификация Дульбекко Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Модифицированная Eagle Medium (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, добавка GlutaMAX™ | Gibco | 10565-018 | высокие концентрации глюкозы, аминокислот и витаминов |
| Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Самооткрывающиеся микроножницы | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Скребки для клеток Fisherbrand (100 шт) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand Высокоточные прямые конические ультратонконаправленные пинцеты/щипцы | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Остроконечные ножницы для препарирования Fisher | Научный | 08-940 | |
| Глицерин | Сигма-Олдрич | G5516 | |
| ГЕПЕС | Сигма-Олдрич | H3375-25Г | |
| Гексадиметрина бромид (полибрен) | Сигма-Олдрич | H9268 | |
| Индометацин | Сигма-Олдрич | I7378 | |
| Инсулин | Сигма-Олдрич | I9278 | |
| ЛигаФаст Рапид Система лигирования ДНК | Promega | M8225 | |
| Maxiprep набор для очистки | Qiagen | 12162 | |
| Микролитровый шприц | Hamilton | 80308 | Модель 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli компетентные клетки |
| pAAV2/8 | Addgene | ||
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | ||
| ПЭГ 8000 | Сигма-Олдрич | 89510 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Гибко | 15140-122 | |
| Полиэтиленимин | Сигма-Олдрич | 23966 | Линейный, MW 25000 |
| Повидон-йод | Риоку; слюда | 510101303 | антисептик |
| Росиглитазон | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| фермент SacI | Новая Англия Biolabs | R0156 | |
| Хирургический дизайн Premier Adson Щипцы | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Шприц | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 ДНК-лигаза | Promega | M180B | |
| Т4 ДНК-лигаза буфер | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK набор ферментов | New England Biolabs | M0201S | |
| Трамадола гидрохлорид | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Бауш + Ломб | 99620 |
Ссылки
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
