AMEBaS: Автоматическое выделение срединной линии и вычитание фона ратиометрических флуоресцентных таймлапсов поляризованных одиночных ячеек

Summary

Современные методы анализа внутриклеточной динамики поляризованных одиночных клеток часто являются ручными и не стандартизированы. В этой рукописи представлен новый конвейер анализа изображений для автоматизации срединного извлечения одиночных поляризованных ячеек и количественной оценки пространственно-временного поведения по временным интервалам в удобном онлайн-интерфейсе.

Abstract

Полярность клеток — это макроскопическое явление, устанавливаемое совокупностью пространственно концентрированных молекул и структур, кульминацией которых является появление специализированных доменов на субклеточном уровне. Он связан с развитием асимметричных морфологических структур, которые лежат в основе ключевых биологических функций, таких как деление клеток, рост и миграция. Кроме того, нарушение полярности клеток связано с тканевыми расстройствами, такими как рак и дисплазия желудка.

Современные методы оценки пространственно-временной динамики флуоресцентных репортеров в отдельных поляризованных клетках часто включают ручные шаги по трассировке средней линии вдоль главной оси клеток, что отнимает много времени и подвержено сильным смещениям. Кроме того, несмотря на то, что ратиометрический анализ может исправить неравномерное распределение репортерных молекул с помощью двух флуоресцентных каналов, методы вычитания фона часто произвольны и не имеют статистической поддержки.

В данной статье представлен новый вычислительный конвейер для автоматизации и количественной оценки пространственно-временного поведения отдельных клеток с использованием модели полярности клеток: рост пыльцевой трубки/корневых волосков и цитозольная ионная динамика. Был разработан трехступенчатый алгоритм для обработки ратиометрических изображений и извлечения количественного представления о внутриклеточной динамике и росте. На первом шаге ячейка отделяется от фона, создавая двоичную маску с помощью метода порогового значения в пространстве интенсивности пикселей. На втором шаге прослеживается путь по средней линии клетки с помощью операции скелетирования. Наконец, на третьем шаге обработанные данные представлены в виде ратиометрического таймлапса и получен ратиометрический кимограф (т.е. 1D-пространственный профиль во времени). Для тестирования метода были использованы данные ратиометрических изображений, полученных с помощью генетически закодированных флуоресцентных репортеров из растущих пыльцевых трубок. Этот конвейер позволяет быстрее, менее смещенно и более точно представлять пространственно-временную динамику вдоль средней линии поляризованных клеток, тем самым расширяя количественный инструментарий, доступный для исследования полярности клеток. Исходный код AMEBaS Python доступен по адресу: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

Полярность клеток является фундаментальным биологическим процессом, в котором согласованное действие набора пространственно концентрированных молекул и структур достигает кульминации в создании специализированных морфологических субклеточных^{доменов.} Деление, рост и миграция клеток зависят от таких участков полярности, в то время как их потеря связана с раком при заболеваниях, связанных с эпителиальной тканью².

Апикально растущие клетки являются ярким примером полярности, когда участок полярности на кончике обычно переориентируется на внеклеточные сигналы³. К ним относятся развивающиеся невриты, грибковые гифы, корневые волоски и пыльцевые трубки, где множественные клеточные процессы демонстрируют выраженные различия от кончика клетки к ножке. В пыльцевых трубках, в частности, полимеризация актина, транспорт везикул и концентрация ионов заметно поляризуются, демонстрируя градиенты, сфокусированные на кончиках⁴. Пыльцевые трубки являются мужскими гаметофитами цветковых растений и отвечают за доставку сперматозоидов к яйцеклетке, растя исключительно на верхушке клетки с одной из самых быстрых скоростей роста, известных для одной клетки. Градиенты ионов, таких как кальций 5 (Ca²+) и протоны 6 (H⁺), играют важную роль в поддержании роста пыльцевой трубки, что необходимо для выполнения ее основной биологической функции, кульминацией которой является двойное оплодотворение ^5,6. Таким образом, количественные методы анализа пространственно-временной динамики вдоль срединной линии апикально растущих клеток имеют важное значение для изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе поляризованного роста ^7,8,9. Исследователи часто используют кимографы, т.е. матрицы, представляющие интенсивность пикселей средней линии клетки (например, столбцов) во времени (например, строк), что позволяет визуализировать рост и миграцию клеток по диагонали (рис. 1). Несмотря на свою полезность, кимографы часто извлекаются путем ручного отслеживания средней линии, что подвержено предвзятости и человеческим ошибкам, а также довольно трудоемко. Это требует автоматизированного метода выделения срединной линии, который является первой особенностью представленного здесь конвейера под названием AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Sутракции ратиометрической флуоресценции поляризованных одиночных клеток.

С точки зрения экспериментальных процедур, количественная визуализация интересующих ионов/молекул/видов в отдельных клетках может быть достигнута с помощью генетически кодируемых флуоресцентных зондов¹⁰. Среди постоянно расширяющегося выбора ратиометрические зонды являются одними из самых точных, поскольку они излучают различные длины волн флуоресценции при связывании/развязывании^{с интересующими} молекулами. Это позволяет корректировать пространственную неоднородность внутриклеточной концентрации зонда за счет соотношения двух каналов с вычитанием их канального специфического фона. Однако оценка фонового порога для каждого канала и точки времени может быть сложной задачей, поскольку он часто изменяется в пространстве из-за таких эффектов, как затенение, когда углы изображения имеют изменение яркости относительно центра, и во времени из-за затухания флуорофора (фотообесцвечивание)¹². Несмотря на то, что существует множество возможных методов, в данной работе предлагается определять интенсивность фона автоматически, используя порог сегментации, полученный с помощью алгоритма Isodata¹³, который затем сглаживается по кадрам с помощью полиномиальной регрессии в качестве стандарта. Однако пространственные компоненты, проистекающие из флуоресцентной гетерогенности, не связанной с клеткой-мишенью, удаленной в¹², были проигнорированы этим методом. Автоматическое пороговое определение может быть выполнено несколькими методами, но алгоритм Isodata дал наилучшие результаты эмпирически. Таким образом, автоматическое вычитание значения фона и ратиометрический расчет являются второй основной особенностью AMEBaS (рис. 1), которая в совокупности получает на вход стопку изображений двухканальной флуоресцентной микроскопии, оценивает срединную линию ячейки и канальный фон, а также выдает кимографы обоих каналов и их соотношение (основной выход #1) после вычитания фона, сглаживания и удаления выбросов. вместе со стопкой ратиометрических изображений (основной выход #2).

AMEBaS был протестирован с помощью флуоресцентных таймлапсов растущих пыльцевых трубок Arabidopsis, полученных под микроскопом, либо с помощью ратиометрических сенсоров Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ или pH (pHluorin)⁶ , экспрессированных под пыльцевым промотором LAT52. Изображения с каждого канала делались каждые 4 с в сочетании с инвертированным микроскопом, камерой с фронтальной подсветкой (2560 пикселей × 2160 пикселей, размер пикселя 6,45 мкм), флуоресцентным осветителем и объективом с погружением в воду 63x, 1,2NA. Для CaMeleon использовались следующие настройки фильтров: возбуждение 426-450 нм (CFP) и 505-515 нм (YFP), излучение 458-487 нм (CFP) и 520-550 нм (YFP), в то время как для pHluorin возбуждение 318-390 нм (DAPI) и 428-475 нм (FITC), излучение 435-448 нм (DAPI) и 523-536 нм (FITC). Для тестирования в Zenodo был добавлен полный набор данных (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Кроме того, трубопровод был протестирован с данными корневых волосков, где визуализация была выполнена с помощью светового листового микроскопа (SPIM), как описано ранее^15,16, с корневыми волосками арабидопсиса^, экспрессирующими генетически кодируемый^Ca2+ репортер NES-YC3.6 под контролем промотора UBQ10 ¹⁷. Самодельное программное обеспечение LabView, которое управляло захватом камеры, перемещением образца и затвором светового микроскопа, позволяло наблюдать два канала cpVenus и CFP, а также визуализировать их соотношение в режиме реального времени. Каждое изображение интервальной съемки представляло собой проекцию максимальной интенсивности (MIP) между изображениями флуоресцентных каналов cpVenus и CFP, полученными из 15 срезов образца, расположенных на расстоянии 3 мкм друг от друга. Интервальная съемка соотношения cpVenus/CFP MIP была сохранена и непосредственно использована для анализа AMEBaS.

Хотя этот конвейер может работать с несколькими типами растущих и мигрирующих клеток, он был специально разработан для анализа растущих клеток, которые растут исключительно на кончике, таких как пыльцевые трубки, корневые волоски и гифы грибов, где существует соответствие нерастущих цитоплазматических областей между рамками. Если такого соответствия нет, пользователь должен выбрать вариант complete_skeletonization на шаге 1.3.1.1 (подробнее см. раздел Обсуждение).

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса конвейера. Конвейер AMEBaS анализирует и обрабатывает микроскопические таймлапсы в три основных этапа: сегментация отдельных клеток, трассировка срединных линий и генерация кимографа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Протокол интерактивной записной книжки

Записную книжку Jupyter можно использовать непосредственно в Интернете с помощью Google Colab в https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, где были основаны приведенные ниже инструкции. Кроме того, записная книжка Jupyter доступна на https://github.com/badain/amebas, где ее можно загрузить и настроить для локального запуска в Jupyter (Anaconda может обеспечить простой и кроссплатформенный процесс установки). Полные данные испытаний можно найти в Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), содержащие одно- и двухканальные данные пыльцевых трубок арабидопсиса, экспрессирующих рН или Ca^{2+ 14}. Конвейер разделен на части, где каждый шаг может быть выполнен нажатием кнопки воспроизведения после установки пользовательских параметров. Необходимые файлы для этого исследования доступны в основной zip-папке AMEBaS (Supplementary Coding File 1).

1. Откройте записную книжку Jupyter и прочтите файлы интервальной съемки.
   1. Перейдите на домашнюю страницу интерактивной записной книжки в Google Colab, упомянутой выше, или загрузите и откройте записную книжку AMEBaS_Local.ipynb с GitHub.
   2. Подготовьте настройку каталога для входных и выходных данных:
      1. Если вы используете локальную версию, поместите интервальную съемку флуоресценции в виде файла TIFF или DV в папку с именем data , которая должна находиться в корневой папке программы. Для получения сгенерированных данных необходимо создать папку с именем . Затем запустите блок кода установки.
      2. Если вы используете блокнот в Google Colab, запустите блок кода установки , чтобы автоматически создать папки данных и исходящих данных.
   3. Запустите блок кода File Input , чтобы прочитать данные интервальной съемки, нажав кнопку воспроизведения . Если вы используете версию блокнота Google Colab, нажмите кнопку «Выбрать файл», чтобы напрямую загрузить файл замедленной съемки в папку данных .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каналов будет автоматически определено в зависимости от размера изображения.
   4. Выберите, будут ли создаваться дополнительные выходные данные каждого шага, установив для параметра verbose значение True или False.
2. Определите основную ячейку и сегмент на фоне (рисунок 2).
   1. Запустите блок кода Сегментация по одной ячейке, чтобы автоматически отделить интересующую ячейку от фона, нажав кнопку воспроизведения .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медианный и Гауссовы фильтры будут применены в качестве шага предварительной обработки для удаления нежелательного шума перед сегментированием переднего плана от фона с помощью порогового значения Isodata и изоляции области наибольшей области для удаления нежелательных артефактов.
      1. Отрегулируйте значение сигмы, используемое Гауссом, в переменной 'sigma', чтобы точно настроить сглаживание маски сегментации. Значение по умолчанию — 2.0.
      2. Установите переменную estimate в False , чтобы сохранить пороговое значение, оцененное непосредственно из Isodata, или в True , чтобы сгладить его по соседним фреймам с помощью локальной полиномиальной регрессии (LOESS). Отрегулируйте его функцию, изменив переменную n_points . Значение по умолчанию — 40.
3. Проведите срединную линию вдоль расширения ячейки (рис. 3).
   1. Запустите блок кода Трассировка средней линии ячейки, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически скелетизировать ячейку с помощью метода¹⁸ Ли и удлинить кончик последнего скелета с помощью линейной экстраполяции.
      1. Выберите трассировку средней линии только в последнем кадре или один раз за кадр, настроив аргумент complete_skeletonization .
         ПРИМЕЧАНИЕ: Когда все кадры скелетизированы, экстраполяция пропускается.
      2. Задайте долю точек в скелете, которые будут интерполированы во время экстраполяции, настроив переменную interpolation_fraction . Значение по умолчанию — 0,25.
      3. Выберите длину экстраполяции средней линии, изменив переменную extrapolation_length. Значение по умолчанию равно -1, что расширяет скелет до ближайшего края.
4. Сгенерируйте кимограммы для каждого канала ( рисунок 4).
   1. Запустите первый блок кода визуализации данных , нажав кнопку воспроизведения , чтобы автоматически создать кимограммы для обоих каналов.
      1. Выберите размер гауссова ядра, используемого для сглаживания, настроив переменную kymograph_kernel.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствует размеру окрестности (в пикселях), по которой усредняются интенсивности пикселов. Значение по умолчанию — 3 x 3 пикселя.
      2. Непротяженные скелеты генерируют кимографы с ограничениями, которые должны использовать пользовательскую цветовую карту для правильного отображения их интенсивности. Выберите долю интенсивности, которая будет присвоена цвету фона, черному, настроив переменную shift_fraction . Значение по умолчанию — 0,7.
5. Рассчитайте соотношение между каналами (рисунок 5).
   1. Запустите второй блок кода Data Visualization , нажав кнопку воспроизведения , чтобы автоматически создать ратиометрический кимограф и ратиометрический таймлапс (рис. 6) .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг доступен только при использовании двухканальной таймлапс-съемки. Порог интенсивности фона, сохраненный на шаге 1.2.1.2, вычитается из каждого канала.
      1. Настройте переменную switch_ratio , чтобы переключить порядок каналов, используемых в качестве числителя и знаменателя во время вычисления соотношения. Значение по умолчанию — False.
      2. Выберите, нужно ли дополнительно сглаживать таймлапс соотношения с помощью прохода фильтра медианы, настроив переменную smooth_ratio . Значение по умолчанию — False.
      3. Выберите, следует ли удалять выбросы, вызванные низким сигналом канала знаменателя, манипулируя переменной reject_outliers . По умолчанию имеет значение True и определяет выбросы как значения, в 1,5 раза превышающие межквартильный диапазон выше третьего квартиля (где находится 75 % значений).
      4. Выберите, нужно ли экспортировать фон в выводе ратиометрии, настроив переменную background_ratio. Значение по умолчанию — False, которое заменяет его нулями.

Рисунок 2: Шаг сегментации одиночных ячеек. Методы обработки изображений, такие как фильтрация, пороговые значения и маркировка областей, используются для изоляции интересующего сигнала (шаг 1.2). Эти данные имели следующие значения: Самая низкая интенсивность: 2556, Медиана: 3441 и Самая высокая интенсивность: 32125. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Обзор трассировки срединной линии - Средняя линия одиночной ячейки получается путем вычисления ее скелета (белый). Кончик (пурпурный) экстраполируется линейно от последних точек в конце скелета (шаг 1.3). В этой композиции и срединная линия, и ее кончик накладываются на исходную клетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Кимографы Timelapse - Сравнение кимографов для каждого канала, сгенерированного с выключенным 'complete_skeletonization' (шаг 1.4). Вертикальная ось описывает ход времени, а горизонтальная ось отображает среднюю интенсивность экстраполированной средней линии, по которой следует одна ячейка. Для этих конкретных данных цветовая карта представляет следующие значения для канала 1: Самая низкая интенсивность: 2886, Медиана: 3167, Максимальная интенсивность: 21021. Канал 2 Самая низкая интенсивность: 3030, Медиана: 3400, Максимальная интенсивность: 29688. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сглаживание фонового порога - Порог фоновой сегментации оценивается с помощью алгоритма изоданных, а затем сглаживается с помощью локальной полиномиальной регрессии (шаг 1.5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Ратиометрические результаты - (A) Сравнение между последним кадром ратиометрического таймлапса и сегментированным исходным первым каналом. (B) Кимограф, сгенерированный на основе ратиометрического таймлапса (шаг 1.5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Протокол пакетного режима

1. Скачайте и поместите файл pipeline.py из репозитория AMEBaS GitHub в тот же каталог, что и данные.
2. Введите местоположение файла в командной строке после файла программы.
3. При необходимости включите - -v в качестве позиционного аргумента, чтобы показать внутренние шаги конвейера.
4. Включите - -s для выбора значения сигмы, используемого на этапе предварительной обработки фильтра Гаусса при подготовке к сегментации ячеек. Значение по умолчанию — 2.
5. Включите - -a для трассировки средней линии для каждого кадра таймлапса. По умолчанию конвейер использует только последний кадр.
6. Включите - -f , чтобы выбрать дробь [0,1] скелета, которая будет использоваться в интерполяции. Значение по умолчанию — 0,25.
7. Включите -e , чтобы выбрать длину экстраполированного скелета в пикселях. Значение по умолчанию равно -1, что расширяет скелет до ближайшего края.
8. Включите - -sf для выбора доли цветового диапазона, которая будет смещена на задний план в неэкстраполированных кимографах. Значение по умолчанию — 0,7.
9. Включите - -k для определения размера ядра, используемого в кимографе Гауссова фильтрация. Значение по умолчанию — 3.
10. Включите - -eb для оценки глобальной пороговой интенсивности фона с помощью полиномиальной регрессии LOESS для пороговых интенсивностей фона для конкретного кадра.
    1. Настройте количество точек, используемых при сглаживании LOESS фоновых пороговых значений, изменив параметр - -n. Значение по умолчанию — 40.
11. Поменяйте местами каналы, используемые в качестве числителя и знаменателя во время вычисления соотношения, включая - r или - -switch_ratio, если таймлапс имеет два канала. По умолчанию второй канал является числителем, а первый — знаменателем.
12. Выберите, нужно ли дополнительно сглаживать таймлапс соотношения с помощью прохода медианного фильтра с аргументом - -sm . Значение по умолчанию — False.
13. Включите -o , чтобы отклонять пиксели с аномальной интенсивностью во время создания ратиометрической интервальной съемки.
14. Выберите, должен ли фон в выводе ratiometric экспортироваться, используя аргумент - -b. Значение по умолчанию — False, которое заменяет его нулями.
15. Нажмите enter , чтобы запустить. Вывод будет сгенерирован в том же каталоге, что и файл программы.

Results

Конвейер AMEBaS автоматизирует извлечение динамики срединной линии поляризованных одиночных клеток из стеков изображений флуоресцентной микроскопии, что делает его менее трудоемким и менее подверженным человеческим ошибкам. Метод количественно оценивает эти временные интервалы путем генерации кимографов и ратиометрических стеков изображений (рис. 1) в растущих одиночных клетках. Его можно настроить для работы с мигрирующими одиночными клетками, но необходимы дальнейшие эксперименты. AMEBaS р...

Discussion

Новый метод, представленный здесь, является мощным инструментом для оптимизации и автоматизации анализа стеков изображений поляризованных клеток флуоресцентной микроскопии. Современные методы, описанные в литературе, такие как плагины ImageJ Kymograph, требуют ручной трассировки средней линии интересующей поляризованной ячейки, что не только отнимает много времени, но и чревато человеческими ошибками. Поскольку определение срединной линии в этом конвейере поддерживается численным методом^18,19, вып...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb