Здесь мы представляем эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов двух клеточных линий рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод 3D-культивирования сфероидов клеточных линий эмбриональных и печеночных рыбок данио-рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клеточные линии рыб являются перспективными моделями in vitro для оценки экотоксичности; однако обычные монослойные культивальные системы (2D-культура) имеют хорошо известные ограничения (например, долговечность культуры и поддержание некоторых клеточных функций in vivo ). Таким образом, были предложены 3D-культуры, такие как сфероиды, поскольку эти модели могут воспроизводить тканеподобные структуры, лучше захватывая условия in vivo . В этой статье описывается эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов с двумя клеточными линиями рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит). Протокол состоит из покрытия ячеек в 96-луночную пластину со сверхнизким дном и сверхнизкой насадкой. После 5 суток при орбитальном встряхивании (70 об/мин) образуется один сфероид на лунку. Сформированные сфероиды имеют стабильный размер и форму, и этот метод позволяет избежать образования нескольких сфероидов в яме; Таким образом, нет необходимости вручную подбирать сфероиды одинаковых размеров. Легкость, скорость и воспроизводимость этого сфероидного метода делают его полезным для высокопроизводительных испытаний in vitro .
Введение
Сфероиды представляют собой небольшие сферы клеток, образующиеся при культивировании клеток в тесном межклеточном контакте в 3D-культуре. Способность сфероидов имитировать тканевую среду in vivo уже была изучена в различных клеточных линиях и первичных клетках 1,2. Однако, несмотря на то, что сфероиды хорошо разработаны для исследований токсичности для млекопитающих, разработка сфероидов для исследований токсичности для позвоночных, не относящихся к млекопитающим (например, рыб), все еще продолжается3. Для клеточных линий рыб сфероиды были разработаны различными методами, таким....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Основные этапы генерации 3D-сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S на 96-луночном планшете с круглым дном представлены на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для растворов и питательных сред, используемых в этом протоколе.
1. Питательная среда для клеточных культур и монослойные культуры
- Выращивайте обе клеточные линии (ZFL, ZEM2S) в виде монослоев в инкубаторе при 28 ° C без CO2 и субкультивируйте их с соо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этим методом формируются одиночные сфероиды на лунку со стабильным размером и формой. На рисунке 2 показан процесс формирования одиночных сфероидов ячеек ZFL и ZEM2S в лунке ULA-пластины при орбитальном встряхивании (70 об/мин). Клеточные линии ZFL и ZEM2S по-разному ведут себя в 3D-культуре. Клеточная линия ZEM2S обладает особенностями, которые придают способность легко формировать сфероидальную форму с первого дня орбитального встряхивания (рис. 2E), в то время как клеточной линии ZFL треб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это простой, легкий и быстрый метод создания сфероидов клеточных линий печени и эмбрионов рыбок данио. Этот метод был разработан этой группой на основе модификаций существующих методов 3D-сфероидов для преодоления проблем, о которых сообщалось в научных исследованиях, связанных с образованием сфероидов, а также неопределенностей в точности данных 3D-сфероидных анализов. Например, проблемы, о которых сообщалось, заключаются в трудностях обработки, трудоемком характере генерации сфероидов, необходимости выбора сфероидов ан.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории кафедры физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticário.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-луночный прозрачный микропланшет с круглым дном и сверхнизким уровнем прикрепления, индивидуально упакованный, с крышкой, стерильный | Corning | 7007 | |
| DMEM, порошок, с высоким содержанием глюкозы, пируват | Gibco | 12800-017 | |
| Смесь питательных веществ Ham's F-12, порошок | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Обработка и анализ изображений в Java ( ImageJ) Программное обеспечение 1.52p | National Institutes of Health, США | Доступно по адресу: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 мм диаметр вращения |
| Dulbeccos PBS (10x) с кальцием и | магнием Invitrogen | 14080055 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 ед/мл) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, одобренные Министерством сельского хозяйства США | регионы Gibco | 12657-029 | |
| Бикарбонат натрия, порошок, биореагент для молекулярной биологии | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Трипановый синий краситель (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красный | Gibco | 15400054 | |
| клеточной линии ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Эта клеточная линия была любезно предоставлена профессором доктором Майклом Дж.<бр/> Карваном (Университет Висконсина, Милуоки, США |
| Клеточная линия ZFL | BCRJ | 256 |
Ссылки
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
