Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод 3D-культивирования сфероидов клеточных линий эмбриональных и печеночных рыбок данио-рерио

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64859

⸱

20 января 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов двух клеточных линий рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит).

Аннотация

Клеточные линии рыб являются перспективными моделями in vitro для оценки экотоксичности; однако обычные монослойные культивальные системы (2D-культура) имеют хорошо известные ограничения (например, долговечность культуры и поддержание некоторых клеточных функций in vivo ). Таким образом, были предложены 3D-культуры, такие как сфероиды, поскольку эти модели могут воспроизводить тканеподобные структуры, лучше захватывая условия in vivo . В этой статье описывается эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов с двумя клеточными линиями рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит). Протокол состоит из покрытия ячеек в 96-луночную пластину со сверхнизким дном и сверхнизкой насадкой. После 5 суток при орбитальном встряхивании (70 об/мин) образуется один сфероид на лунку. Сформированные сфероиды имеют стабильный размер и форму, и этот метод позволяет избежать образования нескольких сфероидов в яме; Таким образом, нет необходимости вручную подбирать сфероиды одинаковых размеров. Легкость, скорость и воспроизводимость этого сфероидного метода делают его полезным для высокопроизводительных испытаний in vitro .

Введение

Сфероиды представляют собой небольшие сферы клеток, образующиеся при культивировании клеток в тесном межклеточном контакте в 3D-культуре. Способность сфероидов имитировать тканевую среду in vivo уже была изучена в различных клеточных линиях и первичных клетках 1,2. Однако, несмотря на то, что сфероиды хорошо разработаны для исследований токсичности для млекопитающих, разработка сфероидов для исследований токсичности для позвоночных, не относящихся к млекопитающим (например, рыб), все еще продолжается3. Для клеточных линий рыб сфероиды были разработаны различными методами, такими как орбитальное встряхивание (OS) с использованием различных типов лунок 3,4,5,6,7 и метод магнитной левитации с использованием магнитных наночастиц 8. Однако некоторые из этих методов культивирования сфероидов могут иметь больше недостатков, чем другие.

Например, гирационные методы в больших микропланшетах (24-луночные пластины) могут генерировать большое количество сфероидов, различающихся по размеру и форме; Действительно, было продемонстрировано формирование многосфероидной структуры7. Это требует интенсивных усилий по подбору сфероидов аналогичного размера и формы для эксперимента. Метод 3D-культивирования висячей капли обычно используется для получения сфероидов клеточных линий млекопитающих 1,2,9,10,11, при этом можно генерировать отдельные сфероиды на каплю, избегая проблем, описанных выше. Однако, хотя модифицированный метод висячего падения (висячая капля + орбитальное встряхивание) способен генерировать сфероиды ZFL с помощью недорогого метода, он имеет свои недостатки12. Образовавшиеся клеточные агрегаты не могут долго сохраняться в каплях; Таким образом, их нужно переносить на скважинные пластины. Этот процесс требует интенсивного обращения и длительных периодов работы в вытяжке с ламинарным потоком, поскольку он выполняется по каплям с помощью микропипетки12. Кроме того, для полного формирования сфероидов ZFL этому методу требуется 10 дней (5 дней в висячей капле + 5 дней в ОС)12. Эти недостатки могут ограничить применение 3D-сфероидов рыб для тестирования токсичности, особенно с учетом потенциальных применений для определения приоритетов химических веществ и устойчивости продукта.

Таким образом, в данной статье описан протокол 3D-культивирования, способный генерировать одиночные сфероиды клеточных линий ZFL (D. rerio normal hepatocyte) и ZEM2S (эмбрион D. rerio blastula phase) на основе комбинированного использования 96-луночных пластин со сверхнизким креплением (ULA-пластины) и орбитального шейкера (диаметр вращения 22 мм). Применяемый метод прост и воспроизводим и может генерировать большое количество сфероидов одинакового размера и формы за короткий период (5 дней). Преимущества этого метода могут способствовать применению 3D-моделей рыб для исследований токсичности в водной среде как в промышленности, так и в научных кругах, а также прогрессу внедрения альтернативных методов тестирования экотоксичности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Основные этапы генерации 3D-сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S на 96-луночном планшете с круглым дном представлены на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для растворов и питательных сред, используемых в этом протоколе.

1. Питательная среда для клеточных культур и монослойные культуры

  1. Выращивайте обе клеточные линии (ZFL, ZEM2S) в виде монослоев в инкубаторе при 28 ° C без CO2 и субкультивируйте их с соотношением субкультивирования 1: 3, когда они достигают ~ 80% слияния.
    1. Начните с колбы T75 с клетками рыбок данио-рерио при слиянии ~ 80%, культивируемых, как описано выше.
    2. Удалите всю среду и промойте клетки, добавив 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (0,01 М) в колбу для культуры с помощью пипетки.
    3. С помощью пипетки добавляют 3 мл 1x трипсина-0,5 мМ ЭДТА (0,05% [об./об.]) в колбы для культивирования и инкубируют при 28 ° C в течение 3 мин для отделения клеток от колбы.
    4. Осторожно постучите по колбе, чтобы освободить клетки, а затем остановите расщепление трипсина, добавив в колбу 3 мл полной питательной среды.
    5. С помощью пипетки перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 100 × г в течение 5 мин.
    6. После образования гранул осторожно удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл полной среды для соответствующей используемой клеточной линии (ZFL или ZEM2S) и ресуспендируйте с помощью микропипетки. Возьмем аликвоту для подсчета ячеек.

2. Подсчет клеток с помощью теста на исключение красителя трипанового синего

  1. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл красителя трипанового синего в микропробирку, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность. Смешайте клеточную суспензию и краситель с помощью пипетки.
  2. Затем перенесите 10 мкл этой смеси (клеточная суспензия + трипановый синий) в камеру Нойбауэра и подсчитайте клетки в четырех больших квадратах (квадрантах: Q), расположенных по углам камеры, считая жизнеспособными клетки, которые не принимают трипановый синий. Рассчитайте количество жизнеспособных клеток, используя уравнение (1):
    figure-protocol-1(1)
  3. Чтобы рассчитать окончательное количество клеток в клеточной суспензии, умножьте количество клеток, определенное с помощью уравнения (1), на 2 (коэффициент разбавления из-за использования трипанового синего).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать автоматизированную систему подсчета ячеек.

3. Обшивка ячеек в ULA-пластинах

  1. После расчета номера ячейки отрегулируйте суспензию ячейки на пластину 200 мкл этой суспензии на лунку 96-луночной УЛА-пластины с круглым дном с количеством ячеек, необходимым для каждой линии ячейки, как указано ниже:
    1. Планшет 7 000 жизнеспособных клеток ZFL / лунка; таким образом, для всей ULA-пластины используют 700 000 клеток в 20 мл полной среды.
    2. Планшет 3 500 жизнеспособных клеток ZEM2S /лунка; таким образом, для всей ULA-пластины используют 350 000 клеток в 20 мл полной среды.
  2. Приготовьте клеточную суспензию с отрегулированной концентрацией клеток в среднем резервуаре и перемешайте ее с помощью многоканальной микропипетки, стараясь не образовывать пену или пузырьки. С помощью многоканальной микропипетки добавьте 200 мкл скорректированной клеточной суспензии в каждую лунку ULA-планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть запечатана парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы избежать испарения питательной среды из 96-луночной пластины.

4. Формирование сфероида

  1. Инкубируйте ULA-пластину на орбитальном шейкере при 70 об/мин в течение 5 дней в инкубаторе с температурой 28 °C. Позвольте сфероидам сформироваться в течение 5 дней орбитального встряхивания (рис. 2), достигнув среднего размера ~ 225 мкм в диаметре (сфероиды ZFL) и ~ 226 мкм в диаметре (сфероиды ZEM2S)12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 5 дней инкубации (максимальная цикличность) сфероиды готовы к использованию.
  2. Для поддержания сфероидов в культуре более 5 дней удаляют 100 мкл отработанной среды каждые 5 дней и добавляют 100 мкл свежей полной питательной среды с помощью многоканальной микропипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не аспирировать сфероиды во время этого процесса.

5. Измерение размера (диаметра) и формы (индекса округлости) сфероидов

  1. Приобретите изображения.
    1. Под микроскопом с инвертированным светом с системой захвата изображений получают изображение определенного масштаба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения шкалы используйте калибровочное предметное стекло микроскопа или предметное стекло Нойбауэра (в котором известны размеры квадрантов).
    2. Под микроскопом и с помощью той же линзы объектива, которая использовалась для получения изображения масштаба, получают изображения полностью сформированных сфероидов (т.е. 5-дневных сфероидов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения должны быть сделаны с использованием одной и той же системы захвата изображений, так как разрешение изображения важно для определения размера и формы сфероидов, и оно может отличаться в зависимости от типа систем.
  2. Установите масштаб.
    1. С помощью программного обеспечения ImageJ откройте изображение заданного масштаба (нажмите Файл | открыть).
    2. Выберите прямой селектор на панели инструментов и с помощью мыши перетащите линию через расширение заданного масштаба на изображении.
    3. Установите масштаб, выбрав «Анализировать» | Установите масштаб и дождитесь открытия окна «Установить масштаб ».
    4. В окне «Задать масштаб» заполните поле «Известное расстояние» известным расстоянием (мкм), соответствующим прямой; Заполните поле Единица длины мкм для мкм. Нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масштаб в пикселях/мкм отображается в нижней части окна.
  3. Установите параметры измерения.
    1. В программном обеспечении ImageJ выберите Analyze | Установите измерения , чтобы открыть окно Установка измерений .
    2. В окне «Задать измерения » установите флажки для нужных измерений (т. е. дескрипторы «Площадь » и « Форма »). Нажмите кнопку ОК.
  4. Получите диаметр и округлость сфероидов.
    1. Откройте изображение сфероида (Файл | Открытый).
    2. Выберите инструмент выделения от руки на панели инструментов и с помощью мыши выделите внешнюю сторону сфероида, как показано на рисунке 3A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить или уменьшить масштаб изображения, нажмите клавишу Ctrl и используйте мышь для прокрутки вниз или вверх или нажмите клавишу Ctrl и используйте клавиши со стрелками вверх или вниз на клавиатуре.
    3. Выберите Анализ | Измерение, чтобы открыть окно Результаты, в котором отображаются измеренные значения.
    4. Используя значение площади , рассчитайте размер (диаметр) сфероидов, используя уравнение (2):
      figure-protocol-2(2)
    5. Индекс цикличности указывается в окне «Результаты» как «Circ.» и автоматически рассчитывается программным обеспечением с использованием уравнения (3):
      figure-protocol-3(3)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс цикличности 1,0 представляет собой идеальную сфероидальную форму, а значение, близкое к 0,0, указывает на вытянутую форму13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этим методом формируются одиночные сфероиды на лунку со стабильным размером и формой. На рисунке 2 показан процесс формирования одиночных сфероидов ячеек ZFL и ZEM2S в лунке ULA-пластины при орбитальном встряхивании (70 об/мин). Клеточные линии ZFL и ZEM2S по-разному ведут себя в 3D-культуре. Клеточная линия ZEM2S обладает особенностями, которые придают способность легко формировать сфероидальную форму с первого дня орбитального встряхивания (рис. 2E), в то время как клеточной линии ZFL треб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это простой, легкий и быстрый метод создания сфероидов клеточных линий печени и эмбрионов рыбок данио. Этот метод был разработан этой группой на основе модификаций существующих методов 3D-сфероидов для преодоления проблем, о которых сообщалось в научных исследованиях, связанных с образованием сфероидов, а также неопределенностей в точности данных 3D-сфероидных анализов. Например, проблемы, о которых сообщалось, заключаются в трудностях обработки, трудоемком характере генерации сфероидов, необходимости выбора сфероидов ан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории кафедры физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticário.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночный прозрачный микропланшет с круглым дном и сверхнизким уровнем прикрепления, индивидуально упакованный, с крышкой, стерильныйCorning7007
DMEM, порошок, с высоким содержанием глюкозы, пируватGibco12800-017
Смесь питательных веществ Ham's F-12, порошокGibco21700026
HEPES (1M)Gibco15630080
Обработка и анализ изображений в Java ( ImageJ) Программное обеспечение 1.52p  National
Institutes of Health, США		Доступно по адресу: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powderGibco41300021
Orbital shaker WarmnestKLD-350-BI22 мм диаметр вращения
Dulbeccos PBS (10x) с кальцием имагнием Invitrogen14080055
пенициллин-стрептомицин (10 000 ед/мл)Gibco15140122
RPMI 1640 MediumGibco31800-014
FBS - Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, одобренные Министерством сельского хозяйства СШАрегионы Gibco12657-029
Бикарбонат натрия, порошок,  биореагент для молекулярной биологииSigma-AldrichS5761
Трипановый синий краситель (0,4%)Gibco15250-061
Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красныйGibco15400054
клеточной линии ZEM2SATCCCRL-2147Эта клеточная линия была любезно предоставлена профессором доктором Майклом Дж.<бр/> Карваном (Университет Висконсина, Милуоки, США
Клеточная линия ZFLBCRJ256
)

Ссылки

  1. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  3. Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
  4. Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).
  5. Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837(2017).
  6. Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).
  7. Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
  8. Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).
  10. Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
  11. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
  12. de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
  13. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
  14. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  15. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  16. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  17. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  18. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  19. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  20. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  21. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
  22. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  23. Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
  24. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  25. Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
  26. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  27. Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
  28. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
  29. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  30. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DZFLZEM2S
Метод 3D-культивирования сфероидов клеточных линий эмбриональных и печеночных рыбок данио-рерио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.