Яркий флуоресцентный зонд NIR-II для визуализации сосудов и опухолей

Флуоресцентная визуализация является широко используемым инструментом молекулярной визуализации в фундаментальных исследованиях, а также часто используется для проведения хирургической резекции опухоли в клиниках¹. Основной принцип флуоресцентной визуализации заключается в использовании камеры для получения флуоресценции, испускаемой лазером после облучения образцов (тканей, органов и т. Д.) ². Процесс завершается в течение нескольких миллисекунд³. Длины волн флуоресцентной визуализации можно разделить на ультрафиолетовую (200-400 нм), видимую область (400-700 нм), ближнюю инфракрасную I (NIR-I, 700-900 нм) и ближнюю инфракрасную II (NIR-II, 1000-1700 нм)^4,5,6. Поскольку эндогенные молекулы, такие как гемоглобин, меланин, дезоксигемоглобин и билирубин в биологических тканях, оказывают сильное поглощающее и рассеивающее действие на свет в видимых областях, проникновение и чувствительность света значительно снижаются, а флуоресцентная визуализация в длинах волн видимого света подвергается неблагоприятному влиянию ^7,8,9.

Флуоресцентная визуализация NIR-II имеет низкое поглощение и рассеяние фотонов, высокую скорость визуализации и высокую контрастность (или чувствительность) ^{изображения10,11}. По мере увеличения длины волны флуоресценции поглощение и рассеяние флуоресценции в биологических тканях постепенно уменьшаются, а автофлуоресценция в области NIR-II чрезвычайно мала¹². Таким образом, окно NIR-II значительно увеличивает глубину проникновения тканей и получает более высокое разрешение и отношение сигнал/шум^13,14,15. Окно NIR-II можно разделить на окна NIR-IIa (1300-1400 нм) и NIR-lIb (1500-1700 нм)¹⁶. На сегодняшний день сообщалось о нескольких основных материалах NIR-II, включая одностенные углеродные нанотрубки из неорганических материалов, редкоземельные наночастицы, квантовые точки и полупроводниковые полимерные наночастицы из органических материалов, низкомолекулярные красители, люминесцентные материалы, индуцированные агрегацией, и т. д. 1,17,18,19,20,21,22. Неорганические наноматериалы легко накапливаются в печени, селезенке и т. д. и обладают потенциальной долгосрочной биотоксичностью²³. Органический низкомолекулярный флуорофор обладает такими преимуществами, как быстрый метаболизм, низкая токсичность, легкая модификация и четкая структура, что является наиболее перспективным зондом для клинического использования²⁴.

Оптическая система визуализации NIR-II также является важнейшим компонентом флуоресцентной биовизуализации, поскольку она может эффективно собирать флуоресцентные сигналы NIR-II от зонда NIR-II, тем самым получая точные функциональные, анатомические и молекулярные изображения^25,26. Система визуализации NIR-II в основном включает в себя коротковолновые инфракрасные камеры, фильтры длинных частот (LP), лазеры и компьютерные процессоры. В естественных условиях Флуоресцентная визуализация NIR-II считается одним из наиболее осуществимых подходов к визуализации для выяснения механизмов заболеваний и характера жизни^27,28,29. Технология визуализации NIR-II широко используется в биомедицинских областях, таких как обнаружение раковых клеток, динамическая визуализация, целевое отслеживание in vivo и таргетная терапия, особенно в онкологических исследованиях^30,31. Однако, учитывая высокие технические требования к технологии визуализации NIR-II к датчикам и инструментам визуализации, это также озадачивает и ограничивает практическое использование исследователей в различных областях. Таким образом, в этой статье подробно рассматривается подготовка датчиков для получения изображений NIR-II и применение изображений NIR-II.

Эксперименты на животных для визуализационных исследований NIR-II были проведены в Центре экспериментов на животных Уханьского университета, который был удостоен награды Международной ассоциации по уходу за экспериментальными животными (AALAC). Все исследования на животных были проведены в соответствии с Руководящими принципами Китайской комиссии по защите животных по уходу и использованию экспериментальных животных и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Экспериментального центра животных Уханьского университета.

Для настоящего исследования использовались самки обнаженных мышей BALB/c (~ 20 г) в возрасте 6 недель.

1. Подготовка к визуализации NIR-II

1. Поместите имеющийся в продаже черный картон (см. Таблицу материалов) в центр носителя. Затем поместите образец поверх черного картона так, чтобы образец находился в центре носителя (столика, расположенного в устройстве формирования изображения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с белым картоном, черный картон имеет меньше фоновых помех во время визуализации NIR-II.
2. Выберите подходящий фильтр в зависимости от длины волны зонда NIR-II. Нажмите и удерживайте (>2 с), чтобы управлять областью коробки (например, 900 LP), соответствующей модели фильтра в экранном интерфейсе, когда система перемещает фильтр в оптический тракт изображения.
3. Нажмите и удерживайте платформу на интерфейсе сенсорного экрана области управления консолью оператора, чтобы консоль оператора поднялась; Нажмите и удерживайте платформу вниз , чтобы несущие консоли опустились.
4. Отрегулируйте высоту платформы на «0 мм» (регулировка высоты) и используйте автоматическую фокусировку, чтобы сделать изображение NIR-II четким.

2. Синтез красителя NIR-II (HLY1)

1. Взвесьте сырье, необходимое для эксперимента по синтезу. Следите за тем, чтобы они не испортились.
2. Добавьте соединение 1 (200 мг, 0,18 ммоль), PdCl 2 (dppf) 2 CH 2 Cl 2 (28 мг, 0,04 ммоль), N-фенил-N- (4- (4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил) фенил) нафталин-2-амин (170 мг, 0,4 ммоль) и K ₂ CO₃ (46 мг, 0,34 ммоль) в раствор тетрагидрофурана (ТГФ) в колбе с круглым дном 25 мл. Перемешивайте смесь в течение 4 ч при 75 °C в атмосфере N₂ (рис. 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры синтеза соединения 1 и N-фенил-N-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)нафталина-2-амина см. Li et al²¹. Химические структуры показаны на рисунке 1А.
3. После охлаждения до температуры окружающей среды погасите реакцию дистиллированной (DI) водой (80 мл) и извлеките смесь DCM (дихлорметаном)/H₂O (30 мл) (три раза). Очистите сырой продукт с помощью колоночной хроматографии¹⁶ (петролейный эфир: DCM = 10: 1), чтобы сделать HLY1 зеленым твердым веществом (78 мг, выход 30%).
4. Поместите краситель HLY1 под защиту азота в холодильник для последующего использования. Это может храниться до 6 месяцев.

3. Приготовление водонастойки нанозонда

1. Взвесьте HLY1 (1 мг) и амфипатические инкапсуляционные материалы, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино (полиэтиленгликоль)-2k (DSPE-PEG2k, 10 мг; см. Таблицу материалов).
2. Подготовьте точки^{HLY1 20} , используя DSPE-PEG2k в качестве матрицы инкапсуляции (метод наноосаждения¹²) (рис. 1C). Растворите HLY1 в ТГФ (1 мл) и медленно добавьте в стакан, содержащий водный раствор DSPE-PEG2k (9 мл) с ультразвуком при 25 ° C. Затем удаляют ТГФ из смеси с помощью диализа²⁰.
3. Концентратируйте вышеуказанный раствор центробежно с помощью ультрафильтрации 18 (7100 x g в течение¹⁰ мин), а затем поместите его в холодильник с температурой 4 °C для будущего использования. Это может храниться до 1 месяца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Водный раствор нанозонда, загруженный DSPE-PEG_2k , следует хранить при температуре выше 0 °C и использовать как можно скорее.

4. Строительство мышей с опухолями

1. Культивируйте клетки рака молочной железы мышей 4T1 (4T1) в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM), дополненную 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином (см. Таблицу материалов), и храните в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ при 37 ° C.
2. Для эксперимента по флуоресцентной визуализации NIR-II культивируют клетки 4T1 (5 x 10⁷) в течение 24 ч, переваривают трипсином (1 мл) и дважды промывают ДМЭМ без сыворотки (4 мл).
3. Обезболивают мышей, обрабатывая изофлураном (2%). Подтвердите адекватную анестезию, стимулируя пальцы ног или подошвы ног мышей, и наблюдайте, реагируют ли мыши. Если ответа нет, значит, анестезии достаточно³².
4. Затем, используя иглу для инъекции инсулина, введите мышам клеточную смесь 4T1 путем подкожной инъекции (100 мкл).
   Примечание: Визуализирующие исследования NIR-II проводились через ~2 недели после инокуляции, когда опухоль выросла до объема ~100^мм3. Перед визуализацией опухоли NIR-II подтвердите размер опухоли. Размер опухоли оценивали с помощью электронного штангенциркуля для настоящего исследования¹¹.

5. Флуоресцентная визуализация in vivo NIR-II

1. Обезболивают мышей, обрабатывая изофлураном (2%), и выполняют визуализацию NIR-II всего тела мышей с использованием оптической системы визуализации NIR-II (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на дозировку анестетика, чтобы избежать гибели мышей. Как правило, анестезия длится 5-10 минут. Стимулируйте пальцы ног или подошвы ног мышей и наблюдайте, реагируют ли мыши. Если ответа нет, значит, анестезии достаточно.
2. Возьмите раствор HLY1 dots (0,8 мг/мл, 200 мкл). Введите точки HLY1 внутривенно анестезированным мышам, а через 3 минуты выполните флуоресцентную визуализацию кровеносных сосудов всего тела мышей NIR-II с помощью системы визуализации NIR-II. Сосредоточьтесь на голове мыши, чтобы получить сосудистую визуализацию мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации используйте чистые экспериментальные перчатки, которые помогут получить чистые изображения NIR-II.
3. Соберите изображения через 5 минут после инъекции точек HLY1 мышам и обработайте данные с помощью программного обеспечения ImageJ. Параметры прибора оптической системы визуализации NIR-II составляют 90 мВт/^см2 (лазер 808 нм).
4. По завершении эксперимента усыпьте животных в соответствии с институционально утвержденными протоколами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования животных усыпляли, подвергая их воздействию избытка изофлурана³².

Интенсивность флуоресценции и яркость водозависимых точек HLY1 определяли с помощью прибора для визуализации NIR-II. Интенсивность флуоресценции HLY1 в смеси 90%f wTHF/H2O была в пять раз выше, чем в растворе THF, что указывало на заметную особенность AIE HLY1 (рис. 1B). Кроме того, точки HLY1 излучали сильные флуоресцентные сигналы под LP-фильтром 1,500 нм, показывая, что точки HLY1 можно использовать для визуализации NIR-IIb (рис. 1D). Максимальное поглощение и максимальная длина волны излучения точек HLY1 составляли 740 нм и 1,040 нм соответственно (рис. 2A). Кроме того, гидродинамический размер точек HLY1 был определен равным 145 нм с помощью динамического рассеяния света (DLS) (рис. 2B). Точки HLY1 (0,2 мл, 0,8 мг/мл) вводили нормальным мышам Balb/c путем инъекции в хвостовую вену для визуализации сосудов (дополнительный рисунок 1). Микрососуды в задней конечности были четко идентифицированы под фильтром LP 1,500 нм (рис. 3B). Кроме того, сосуды головного мозга также были четко идентифицированы под фильтром LP 1,500 нм (рис. 3A). Эффективность визуализации NIR-II точек HLY1 у мышей с опухолями 4T1 также оценивалась с помощью системы визуализации NIR-II. Точки HLY1 (0,2 мл, 0,8 мг/мл) вводили внутривенно мышам 4T1 через хвостовую вену. Опухоль 4T1 мышей с опухолями была хорошо видна при визуализации NIR-II (рис. 3C), что указывает на эффект ЭПР точек HLY1. Все эти результаты свидетельствуют о том, что точки HLY1 представляют собой яркий флуоресцентный зонд NIR-II, который применим для визуализации сосудов и опухолей.

Рисунок 1: Синтез молекул красителя и приготовление водостойких зондов. (A) Синтетический путь HLY1 (a: Pd(dppf)Cl 2 CH 2 Cl 2, K 2 CO3, 75 °C). (B) Изображения NIR-II HLY1 в ТГФ и 90% f w THF/H 2 O (1,000 нм LP,2мс). (C) Принципиальная схема приготовления точек HLY1. (D) Интенсивность флуоресценции NIR-IIb точек HLY1 в водном растворе (1 500 нм LP, 200 мс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Оптические свойства и гидродинамический размер точек HLY1 . (A) Спектры поглощения и излучения точек HLY1 в водном растворе. (B) DLS точек HLY1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Флуоресцентная визуализация NIR-II с использованием точек HLY1. (A) Визуализация сосудов головного мозга у мышей (1,500 нм LP, время экспозиции 300 мс). Масштабная линейка: 2 см. (B) Визуализация сосудов всего тела у мышей (1,500 нм LP, 300 мс). (C) Визуализация опухоли 4T1 (1,250 нм LP, 30 мс). Масштабная линейка: 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Установка визуализации NIR-II. (A) Принципиальная схема инъекции точек HLY1 мышам. (B) Фотография устройства формирования изображения NIR-II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам раскрывать нечего.