$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
В последнее десятилетие наблюдается всплеск интереса к применению когерентной рамановской микроскопии (CRM) для визуализации клеток и тканей 1,2. CRM — это мощный метод химической визуализации с двумя популярными вариантами: когерентная микроскопия антистоксовского комбинационного рассеяния (CARS) и микроскопия вынужденного комбинационного рассеяния (SRS). SRS становится все более популярной по сравнению с CARS, поскольку она меньше подвержена влиянию некомбинационных фоновых помех и имеет линейную зависимость от концентрации3. CRM получает информацию о молекулярных вибрациях аналогично рамановской спектроскопии, но обеспечивает значительно более высокую скорость сбораданных 4. Это достигается за счет когерентного вибрационного возбуждения через пару импульсных лазеров с высокой пиковой интенсивностью. Поскольку CRM обеспечивает пространственное химическое картирование с высоким пространственным и временным разрешением, он нашел важное применение в диагностике рака, метаболизме липидов, клеточном метаболизме, транспорте лекарств и многих других 5,6,7,8. Тем не менее, одним из основных узких мест, препятствующих широкому внедрению этого метода, является его техническая сложность и отсутствие стандартизированных протоколов. Несмотря на то, что коммерческие лазеры и микроскопы уже доступны, почти все системы, которые в настоящее время используются в этой области, включают в себя различные уровни настройки лазеров, оптики, микроскопов и детекторов, что создает значительный барьер для исследователей, заинтересованных в выходе в эту область или внедрении этой технологии. Отсутствие доступа еще больше затрудняет биологическое применение. Целью данной коллекции методов является предоставление подробных примеров и рекомендаций по инструментам, новым подходам к визуализации и приложениям визуализации клеток или тканей in vitro/in vivo. Мы включили семь публикаций экспертов в этой области, которые кратко изложены здесь.
Clark et al. представляют параллельное сравнение гиперспектральных SRS и CARS с точки зрения чувствительности, пространственного разрешения и спектрального разрешения9. Оба метода реализуются со спектральной фокусировкой фемтосекундных лазеров, широко используемым подходом, который использует спектрально чирпированные широкополосные фемтосекундные лазеры для достижения узкополосного разрешения комбинационного рассеяния. Прямое сравнение позволяет оценить различия в обнаружении и оптимально выбрать модальность для различных областей применения химической визуализации.
Де ла Кадена и др. опубликовали новый мультиплексный метод SRS, которыйможет быстро получать широкополосные изображения SRS. Этот метод основан на специальном дифференциальном многоканальном синхронном детектировании усилителя, который позволяет обнаруживать до 32 каналов одновременно. Кроме того, показана подробная характеристика шума и продемонстрирован сбалансированный метод детектирования для устранения лазерного шума. Этот протокол предоставляет практическое руководство для пользователей, заинтересованных в построении мультиплексных систем SRS.
Shi et al. демонстрируют использование высокомультиплексных красителей комбинационного рассеяния света в визуализации SRS11. С помощью предрезонансного усиления они демонстрируют, что SRS может обеспечить чувствительность, сравнимую со стандартной иммунофлуоресценцией. Этот метод позволяет обойти предел спектрально разрешаемых каналов при обычной иммунофлуоресценции и позволяет проводить мониторинг многих белков одновременно и изучать их взаимодействия. Подробное руководство по обработке образцов и окрашиванию рамановским красителем прилагается для облегчения внедрения этого мощного метода.
Miao et al. представляют вибрационную визуализацию набухшей ткани и анализ (VISTA), метод визуализации со сверхвысоким разрешением, который сочетает в себе SRS с экспансионной микроскопией12. VISTA обходит препятствия, связанные с флуоресцентной визуализацией, и обеспечивает объемную визуализацию сверхвысокого разрешения без меток в биологических образцах с пространственным разрешением до 78 нм. Кроме того, они используют алгоритм глубокого обучения для достижения многокомпонентной сегментации, включая белковые агрегаты в клетках и тканях мозга.
Espinoza et al. представляют использование двухцветной SRS-визуализации белков и липидов в режиме реального времени для диагностических приложений тканей13. Двухцветная визуализация SRS может генерировать H&E-эквивалентные изображения для патологоанатомических приложений. Этот протокол подробно описывает реализацию метода ортогональной модуляции и спектральной фокусировки для одновременной двухцветной визуализации SRS. Преобразование двухцветных изображений SRS в псевдо-H&E изображения также демонстрируется на тканях мозга мышей для иллюстрации приложений для диагностики тканей.
Yuan et al. публикуют гибкую камерную систему для долгосрочной SRS-визуализации живых клеток14. Большинство существующих камер наблюдения за живыми клетками предназначены для визуализации в светлом поле и флуоресценции. Они несовместимы с детектированием SRS из-за требований к объективу и конденсатору с высоким уровнем NA. Авторы демонстрируют 24-часовую покадровую визуализацию SRS с помощью гибкой камеры, которая поддерживает постоянную температуру,CO2 и влажность.
Наконец, Wu et al. демонстрируют одновременную двухфотонную флуоресценцию in vivo (TPEF) и SRS-визуализацию15. Две отдельные лазерные системы объединены для достижения оптимальной чувствительности для обоих методов визуализации и предоставления дополнительной информации. В естественных условиях Визуализация тканей при СЛС сопряжена с уникальными проблемами из-за необходимости эпидетекции деполяризованного, обратно рассеянного света. В этом протоколе подробно описывается оптимальная настройка микроскопа TPEF-SRS и то, как его можно использовать для визуализации спинного мозга мыши in vivo .
Эта коллекция публикаций представляет собой современное состояние оборудования CRM и технические достижения. Исследователи, заинтересованные как в разработке методов, так и в их применении, найдут эту коллекцию полезной для сравнения установок и установления контрольных показателей (чувствительность, разрешение и т. д.) для создания или оптимизации своих собственных систем. Рекомендации и передовые практики, представленные в этих протоколах, будут использоваться в существующих и будущих приложениях in vitro и in vivo . Широкомасштабное внедрение технологии CRM все еще ожидает ключевых и инновационных приложений и коммерциализации комплексных CRM-решений. Тем не менее, стандартизация подходов к визуализации и контрольных показателей имеет важное значение для обеспечения воспроизводимости и надежности, а также для содействия более широкому внедрению CRM16.
Сфера CRM развивается стремительными темпами. Технические разработки, повышающие чувствительность, специфичность и разрешение, продолжают выводить технологию на новые территории. Например, пространственное разрешение SRS начинает превышать дифракционный предел17,18. Чувствительность электронного предрезонанса SRS в настоящее время приближается к чувствительности флуоресценции19. По сравнению с флуоресцентной, CRM имеет явные преимущества. Например, использование метода отслеживания дейтерия позволило впервые in vivo изучить метаболическую динамику малых молекул с субклеточнымразрешением20. С помощью небольших меток можно выполнять высокомультиплексное комбинационное обнаружение 24 или более меченых целей21. Достижения в области искусственного интеллекта открывают новые возможности CRM, используя ее высокую информативность и молекулярно-специфические особенности для сегментации и классификации объектов с тонкими пространственными и спектральными различиями22. В совокупности эти технические достижения в CRM готовы ускорить и расширить применение как в биологической, так и в биомедицинской визуализации.