Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение кинетики жировой ткани in vivo у человека с использованием метода маркировки дейтерием (2H)

721 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

21 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол измерения кинетики жировой ткани in vivo у человека с использованием метода мечения дейтерием (2H).

Аннотация

Белая жировая ткань является высокопластичным органом, который необходим для поддержания энергетического гомеостаза всего организма. Масса жировой ткани и изменения в жировой массе или распределении регулируются изменениями в синтезе и разрушении (т.е. обороте) жировых клеток и триацилглицеринов. Данные свидетельствуют о том, что способ и величина расширения подкожной жировой ткани (т.е. гипертрофия по сравнению с гиперплазией) и оборот могут влиять на метаболическое здоровье, поскольку адипогенез участвует в патогенезе ожирения и связанных с ним заболеваний. Несмотря на потенциальную роль жирового оборота в здоровье человека, существует недостаток знаний о кинетике жировых клеток in vivo . Отчасти это связано с медленной скоростью обновления клеток в жировой ткани и практической сложностью прямого обозначения их метаболических предшественников in vivo. В данной работе мы описываем методы измерения in vivo кинетики жировой ткани и скорости обмена у людей при потреблении воды, меченной дейтерием (2H). Включение 2H в дезоксирибонуклеотидные фрагменты ДНК в преадипоцитах и адипоцитах обеспечивает точное измерение образования и гибели клеток (жировой оборот). В целом, это инновационный подход к измерению кинетики жировой ткани in vivo и представляет собой существенный отход от других оценок in vitro .

Введение

Ожирение – заболевание, характеризующееся избытком белой жировой ткани (АТ) и являющееся значимым фактором риска развития сахарного диабета II типа и сердечно-сосудистых заболеваний1. Белая АТ является высокопластичным органом, который накапливает энергию в форме триацилглицеринов (ТГ) и необходим для метаболического гомеостаза2. Белая АТ сохраняет способность к расширению, уменьшению и ремоделированию во взросломвозрасте3, а масса АТ определяется динамическими изменениями объема адипоцитов (посредством синтеза и распада ТГ), непрерывным образованием адипоцитов посредством пролиферации и дифференцировки преадипоцитов (т.е. гиперплазией или адипогенезом)и гибелью жировых клеток4.

Данные свидетельствуют о том, что существует важная связь между подкожным оборотом АТ (например, образованием и гибелью адипоцитов) и кардиометаболическим здоровьем 5,6,7,8, а роль адипогенеза в патогенезе расстройств, связанных с ожирением, остается спорной4. Тем не менее, мало что известно об обмене АТ in vivo у людей, отчасти из-за медленной скорости обновления клеточных компонентов АТ и сложности прямой маркировки их метаболических предшественников in vivo. Несмотря на то, что методы in vitro дают некоторое понимание, эти подходы не обеспечивают всесторонней оценки in vivo в естественной среде АТ.

Лабораторией Хеллерштайна 9 был разработан метод оценки оборота АТ in vivo с использованием включения стабильного изотопа дейтерия (2H) из тяжелой воды (2H,2O) в АТ (рис. 1)10. Протокол, который был валидирован на мышах и людях, включает в себя первоначальное увеличение до 2H2O для увеличения обогащения воды организмом на 2H с последующим адекватным ежедневным потреблением для поддержания стабильных значений обогащения, близких к плато. 2H из 2H2O (т.е. тяжелая вода) включается в дезоксирибозный (dR) фрагмент дезоксирибонуклеотидов в ДНК жировых клеток, а обогащение изотопами измеряется в ДНК с помощью масс-спектрометрии и применения анализа распределения массовых изотопомеров (MIDA)9,10,11. Мечение дезоксирибозного фрагмента пуриновых дезоксирибонуклеотидов в ДНК стабильными изотопными предшественниками имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими методами, такими как те, которые включали мечение пиримидиновыми нуклеотидными основаниями (например, из 3-H-тимидина или бромдезоксиуридина). Следует отметить, что эндогенное повторное включение оснований, особенно пиримидинов, но не dR, в реплицирующуюся ДНК ранее затрудняло интерпретацию инкорпорации меток12. Кроме того, включение метки стабильного изотопа в dR не вызывает генотоксичности, в отличие от включения радиоактивных или генотоксических агентов, таких как 3Н (тритий) или бромдезоксиуридин. Поэтому долгосрочное использование этой методики на животных моделях и людях безопасно.

Измерение синтеза 2-H-меченой ДНК обозначает прохождение клетки через S-фазу клеточного деления и идентифицирует вновь образованные преадипоциты и адипоциты (посредством дифференцировки преадипоцитов) или адипогенез13. Клетки, которые подвергаются быстрому обороту (например, моноциты), быстро заменяют свою ДНК и достигают плато в2H-обогащении, обеспечивая таким образом внутренний эталон для анализа. Соотношение 2H-обогащения ДНК жировых клеток к ДНК моноцитов (референтных клеток) или измерение интегрированного тела 2H2O позволяет рассчитать долю вновь синтезированных жировых клеток. В настоящем протоколе описаны методы измерения скорости обновления жировых клеток (адипогенеза) in vivo у человека с помощью протокола метаболического мечения 2H, включая усовершенствованные методы очистки адипоцитов посредством отрицательного иммунного отбора и обогащения популяции преадипоцитов14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Институциональный наблюдательный совет (IRB) Пеннингтонского биомедицинского исследовательского центра одобрил все процедуры (#10039-PBRC), и все люди дали письменное информированное согласие.

1. Восьмая неделя 2Ч2Период О-маркировки

  1. Вводите аликвоты с содержанием 70% или 99,9% воды, меченной дейтерием (2Н2О) в стерильные пластиковые контейнеры.
  2. Проинструктируйте участников пить 35 мл доз 99,9% обогащенных 2Н2О или 40 мл 70% обогащенных 2Н2О три раза в день в течение 1 недели (подготовительный период) и пить две дозы 35 мл или 50 мл соответственно в день в течение 2-8 недель.
    Примечание: Преходящее головокружение или вертиго являются единственными известными побочными эффектами приема 2Н2О и связаны с быстрыми изменениями в объемном потоке воды, которые воспринимаются волосяными фолликулами внутреннего уха. Следовательно, проинструктируйте участников принимать дозы с интервалом не менее ~2 часов, чтобы избежать редкого возникновения преходящего головокружения или вертиго15. По той же причине не восполняйте пропущенные дозы, удваивая одну дозу. Введение дозы, как описано выше (с интервалом в ≥2 ч), делает этот побочный эффект крайне редким у людей (<1% из нескольких сотен субъектов).
  3. Контролируйте соблюдение нормы потребления 2Н2О с помощью сборов мочи для измерения обогащения 2 Н в воде организма, а также путем еженедельного возврата пустых флаконов для подсчета.
    1. Очистите образцы мочи с помощью активированного угля и фильтра.
      1. Добавьте 8 мл мочи в 10 мл пробирки с 1 мл активированного угля.
      2. Поместите образец на коромысло на 10 минут и центрифугируйте в течение 5 минут при 800 x g , чтобы древесный уголь переместился на дно пробирки. Отфильтруйте образец с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм.
    2. Измерьте обогащение 2H2O в воде (моче) организма с помощью масс-спектрометрии изотопного отношения (IRMS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащение 2H2O может быть проанализировано различными методами, включая газовую хроматографию-масс-спектрометрию16, высокотемпературный конверсионный элементный анализатор (TC/EA) в сочетании с IRMS17, резонаторную кольцевую инфракрасную спектроскопию (IRIS)18 или с помощью H/устройства, прикрепленного к масс-спектрометру (например, IRMS)19.
    3. Используйте среднее значение обогащения 2H2O, измеренное в моче в течение 8-недельного периода мечения, для расчета экспозиции предшественника 2H2O и доли вновь синтезированных клеток АТ (см. раздел 7 и раздел 8 ниже).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол мечения 2Н2О поддерживает обогащение воды организма на уровне, близком к плато,в диапазоне от 1,0% до 2,5% в течение 8-недельного периода мечения (Рисунок 2)10.

2. Биопсия жировой ткани у людей

  1. После очищения кожи раствором повидон-йода введите местную анестезию (например, 2% лидокаин/0,5% бупивакаин), сделайте разрез на коже ~0,75 см и соберите подкожные биопсии АТ с помощью техники игольчатой липоаспирации в стерильных условиях13.
  2. Взвесьте стерильную пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл буфера комнатной температуры (ОТ) 1 М HEPES, pH 7,3. Немедленно поместите АТ в пробирку с буфером HEPES для обработки.
  3. Взвесьте 50 мл пробирки, содержащей АТ, и запишите вес.

3. Выделение очищенных адипоцитов

  1. Добавьте раствор коллагеназы типа 1 /HEPES (2 мг/мл) в 2 г/мл АТ.
  2. Переваривают АТ путем инкубации на водяной бане с встряхиванием (100 об/мин) в течение 1 ч при 37 °C до получения однородной смеси с несколькими крупными неповрежденными кусочками АТ.
  3. Центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 8 мин при ЛТ, чтобы отделить адипоциты и стромально-васкулярную фракцию (SVF).
  4. Аккуратно удалите верхний жировой слой (адипоциты), и переложите его в отдельную пробирку. Не нарушайте расположение гранулы (SVF) на дне трубки.
  5. Как описано ранее14, очистите адипоциты с помощью иммуномагнитного разделения клеток.
    Примечание: Этот важный шаг делается для «очистки» адипоцитов, так как другие типы клеток с быстрым клеточным обновлением, включая гемопоэтические, эндотелиальные и стволовые клетки, могут прилипать к плавающим адипоцитам и влиять на измерения.
    1. Поместите ~400 мкл адипоцитов в пробирку объемом 5 мл для отрицательной иммуноочистки.
    2. Добавьте антитела, блокирующие FcR (100 мкл/мл).
    3. Добавьте коктейль биотинилированных антител против маркеров эндотелиальных клеток (античеловеческий CD31; 1:100), гемопоэтических клеток (античеловеческий CD45; 1:400) и мезенхимальных стволовых клеток (античеловеческий CD34; 1:100) в раствор адипоцитов в течение 15 мин в ЛТ.
    4. Добавьте в раствор адипоцитов отборный биотиновый коктейль (100 μл/мл), хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при RT с осторожным наклоном/вращением.
    5. Смешайте магнитные наночастицы с помощью пипетирования вверх и вниз, добавьте частицы (50 мкл/мл) в раствор адипоцитов, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 10 мин при РТ с мягким вращением (10 об/мин).
    6. Добавьте PBS/2% FBS/1 мМ буфер ЭДТА в раствор адипоцитов в общем объеме 1 мл.
    7. Поместите трубку в магнит и оставьте на 5 минут.
    8. Возьмите магнит и одним непрерывным движением переверните магнит, в котором находится тюбик, и вылейте содержимое в новую пробирку объемом 5 мл. Не постукивайте по тюбику во время заливки. Клетки, прикрепленные к антителам, связываются магнитными наночастицами и удаляются, в то время как иммуноочищенные адипоциты сохраняются.
    9. Очищенные адипоциты мгновенно заморозьте в жидкости N2 и храните при температуре −80 °C до извлечения ДНК.

4. Выделение преадипоцитов

  1. Чтобы изолировать обогащенную популяцию преадипоцитов, используйте протокол, чтобы использовать их способность прикрепляться к пластику после кратковременного культивирования SVF20.
  2. В ламинарном проточном колпаке ресуспендировать гранулу SVF в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 5-10 мин при RT (тщательно перемешать) и центрифугировать при 800 x g. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10% FBS в альфа (α)MEM.
  3. Поместите клетки на пластиковую чашку для культивирования в течение ~8-12 часов в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2 .
  4. Через ~8-12 ч аккуратно промойте неадгезивные клетки из культурального планшета PBS внутри ламинарного проточного колпака.
  5. После аспирации PBS добавьте 1-1,5 мл 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в чашку для культивирования для отделения адгезивных клеток (обогащенной популяции преадипоцитов). Поместите чашку для культивирования в инкубатор при температуре 37 °C на ~5-8 минут, чтобы помочь поднять клетки.
  6. Добавьте 10% FBS/αMEM в планшет и тщательно промойте планшет, чтобы собрать все элементы с планшета. Перелейте раствор клетки в пробирку объемом 15 мл или 50 мл и центрифугируйте при 800 x g в течение 8 минут.
  7. Удалите надосадочную жидкость и храните гранулу (преадипоциты) при температуре −80 °C до извлечения ДНК.

5. Выделение моноцитов крови

Моноциты анализируются как представляющие (почти) полностью перевернутую клеточную популяцию, и измерение обогащения 2Н в моноцитах может быть использовано в качестве референсного маркера экспозиции 2Н2О у каждого индивидуума. В качестве альтернативы можно измерить обогащение организма 2H2O и использовать его для расчета экспозиции 2H2O.

  1. Возьмите свежую цельную кровь человека в вакутайнерные пробирки, содержащие ЭДТА.
  2. Центрифугируйте кровь при 1000-2000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте тормоз.
  3. Снимите верхний слой плазмы. Будьте осторожны, чтобы не задеть белую охристую шерсть прямо под плазмой.
  4. Отсадите белую охристую шерсть с помощью переводной пипетки и переложите ее в пробирку объемом 50 мл. Добавьте ~10 мл PBS в охристое пальто.
  5. Аккуратно добавьте 10 мл градиента плотности среднего слоя для слоя охристого слоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик пипетки касается дна пробирки, и осторожно извлеките пипетку, чтобы на дне был прозрачный слой среды с градиентом плотности. Избегайте образования пузырей.
  6. Центрифугируйте пробирку при давлении 800 x g в течение 30 минут при выключенном тормозе.
  7. Выведите пипетку (~10 мл) из белого слоя (мононуклеарной фракции), совершая круговые движения кончиком переводной пипетки близко к краю, но не касаясь верхнего слоя. Переложите в новую пробирку объемом 50 мл и добавьте 10 мл PBS. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут (не используйте тормоз) и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Добавьте в гранулу 5 мл буфера для лизиса эритроцитов. Перемешайте и оставьте на 2 минуты на RT.
  9. Добавьте 5 мл PBS с 0,1% BSA в буфер/гранулированный раствор для лизиса эритроцитов, центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  10. Выделите моноциты в виде CD14+ клеток с помощью иммуномагнитных шариков. Выполните выделение клеток CD14+ , следуя протоколу производителя.
  11. Храните выделенные моноциты при температуре −80 °C до экстракции ДНК.

6. Подготовка ДНК (выделение, гидролиз и дериватизация)

  1. Выделите ДНК из преадипоцитов, адипоцитов и моноцитов крови с помощью набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Чтобы высвободить дезоксирибонуклеозиды, ферментативно гидролизуйте ДНК (~200 мкл) в течение ночи (не более 24 ч) при 37 °C в 50 мкл ферментного гидролизного коктейля, содержащего 1 мл S1-нуклеазы, 1 мл фермента фосфатазы и 36,8 мл 5-кратного гидролизного буфера в стеклянных пробирках с завинчивающейся крышкой размером 16 мм x 100 мм (10 мл). Кроме того, включите следующие образцы: заготовку для воды, заготовку для коктейля для гидролиза, заготовку колонки из набора для экстракции ДНК и 500 нг стандартов ДНК.
    1. Чтобы приготовить 5-кратный буфер для гидролиза, поместите 94 мл чистой воды, пригодной для молекулярной биологии, в стерильный стакан. Взвесьте 3,08 г ацетата натрия и 21,5 мг сульфата цинка, добавьте воды и перемешайте до полного растворения. Отрегулируйте pH до 5,0 с помощью ледяной уксусной кислоты и проверьте с помощью бумаги pH. Добавьте воду до полного объема 100 мл.
    2. Для приготовления фермента фосфатазы необходимо ресуспендировать флакон кислой фосфатазы в 1 мл чистой воды.
    3. Для получения фермента нуклеазы S1 в концентрации 0,5 ед/мкл разбавьте 2,5 мкл нуклеазы S1 в 2 мл 1x гидролизного буфера (добавьте 1 мл 5x гидролизного буфера на 4 мл чистой воды).
  3. Дериватизируйте гидролизаты до производных пентафторбензилгидроксиламина (PFBHA). В частности, добавьте непосредственно к расщепленным образцам ДНК, включая стандарты и заготовки, в пробирках с завинчивающейся крышкой размером 16 мм x 100 мм (10 мл): 100 мкл пентафторбензилгидроксиламина гидрохлорида (PFBHA; 1 мг/мл) и 75 мкл ледяной уксусной кислоты. Вдохните (кратко), закройте флаконы крышками и поместите образцы гидролизата на нагревательный блок, установленный при температуре 100 °C, на 30 минут.
  4. Извлеките образцы и дайте им остыть в течение ~5 минут до температуры RT. После охлаждения добавьте 2 мл уксусного ангидрида и 100 мкл 1-метилимидазола в каждую пробирку под вытяжным шкафом. Установите трубки на нагревательный блок при температуре 100 °C на 5 минут.
  5. Извлеките образцы, а затем дайте им остыть в течение ~15-20 минут. Когда остынет, добавьте 3 мл воды молекулярно-биологического качества к каждому образцу, быстро перебейте его и оставьте на 10 минут.
  6. Добавьте в пробирки 2 мл дихлорметана (DCM) и энергично переведите образцы в течение 15 с, чтобы извлечь производное в органическую фазу.
  7. Центрифугируйте при давлении 800 x g в течение 5 минут для разделения фаз. Осторожно переложите нижний слой дихлорметана в чистый флакон GC объемом 1,6 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавайте водную фазу, так как это приведет к увеличению фона.
  8. Выпарить до сухости с азотом в течение ~20 минут, чтобы удалить DCM и остаточную уксусную кислоту, затем высушить ~10 минут в скоростном вакууме при RT, чтобы удалить все следы реагентов.

7. Газовый хромато-масс-спектрометрический анализ (ГХ-МС) анализа ДНК

  1. После высыхания ресуспендируйте производные PFBHA в 150 мкл этилацетата и колпачк. Затем проведите анализ на предмет включения 2Н в ДНК на приборе для газовой хроматографии (ГХ)/масс-спектрометрии (МС), оснащенном колонкой DB-225, с использованием ионизации метана с отрицательным химическим излучением и сбором ионов в режиме селективного ионного мониторинга в точках m/z 435, m/z 436 и m/z 437 (представляющих массовые изотопомеры M0, M1 и M2 ). соответственно). Следуйте инструкциям производителя для используемого инструмента.
    1. Установите следующие условия для ГХ: колонна: внутренний диаметр 30 м x 0,25 мм x пленочное покрытие 0,25 мкм; хроматограф: газообразный гелиевый носитель при постоянном расходе 1,0 мл/мин; импульсные бесщеплевые инъектры; температура инжектора: 250 °C; Передаточная линия MS: 325 °C; Условия печи: начальная температура 100 °C, выдержка 2 мин, линейная скорость при 40 °C/мин до температуры 220 °C, выдержка 7,5 мин, вторая линейка при 40 °C/мин до 320 °C, выдержка 1 минута. Общее время выполнения составляет 16,0 мин. Типичное время элюирования dR составляет 10,5 мин и 10,8 мин для первого и второго пиков соответственно.
    2. Задайте следующие условия МС: источник ионизации метана отрицательного химического вещества с детектированием в режиме мониторинга одиночных ионов; ионы, собранные для dR: m/z 435, m/z 436 и m/z 437 (представляют собой массовые изотопомеры M0, M1 и M2 соответственно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконизируйте открытый стеклянный вкладыш с помощью небольшой пробки из силиконизированной стекловаты в нижней части вкладыша. Меняйте этот вкладыш часто (каждые ~100 инъекций).
  2. Рассчитаем массовое соотношение распространенности изотопомеров M1 в необогащенном (естественном распространении) производном dR следующим образом:
    Коэффициент M1 = распространенность M1/(сумма обилий M0, M1 и M2)
    Затем вычтите естественные отношения распространенности M1 из отношений M1 в dR меченых образцов, чтобы рассчитать обогащения (избыточное содержание изотопов, или %EM1)21.
  3. Измерьте массовое содержание изотопомеров базовых (необогащенных) стандартов ДНК одновременно в диапазоне содержания ионов M0, которые охватывают диапазон распространенности ионов M0 в анализируемых образцах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для коррекции «чувствительности к распространенности» изотопных соотношений, измеренной с помощью GC/MS22.
  4. Постройте график измеренной распространенности ионов M0 в зависимости от измеренных массовых соотношений изотопомеров M1 в немаркированных стандартах, чтобы определить концентрацию образца в колонке, которая является наиболее точной для массового изотопомера M1 (т. е. где она наиболее близка к известному, рассчитанному естественному отношению M1 или «золотой середине»). Коэффициент M1 для этой необогащенной производной dR составляет 0,1669.
  5. Вводите экспериментальные образцы так, чтобы они находились как можно ближе в области пика M0 к этой «зоне наилучшего восприятия». Используйте квадратичную регрессию отношения М1 необогащенных стандартов по отношению к пиковой площади М0 для оценки «скорректированного естественного изобилия» отношения М1 для каждого образца при его конкретной концентрации М0. Вычтите это из соотношения M1 образца жировой клетки, чтобы получить процент обогащения выше естественного изобилия, или %EM1 (рис. 3)23.
  6. Рассчитайте теоретическое максимальное обогащениеМ1 (EM1*) в жировых клетках с использованием уравнений24 для анализа распределения массовых изотопомеров (MIDA) на основе интегрированной в организм экспозицииН2Н2О(измеренной в моче) за 8-недельный период (рис. 4) или промежуточного измеренного обогащения моноцитов (шаг 7.5).

8. Расчет доли вновь синтезированных клеток, или адипогенез in vivo

  1. Рассчитайте долю новых клеток (%), которая является мерой адипогенеза in vivo или образования вновь синтезированных преадипоцитов или адипоцитов, используя следующую формулу:
    Доля новых клеток (%) = [(обогащениеМ1 в образце [жировых] клеток)/EM1* (теоретическое максимальное обогащениеМ1 )] х 100
    Примечание: *Обогащение моноцитов2 H также может быть использовано в качестве знаменателя уравнения. Это измерение в моноцитах представляет собой референсный клеточный маркер экспозиции 2H2O у каждого индивидуума и может быть использовано для подтверждения расчетов теоретического максимального обогащения M1из измеренных значений тела 2H2O.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол мечения 2Н2О (раздел 1) поддерживает обогащение 2 Н в воде организма, близком к плато,в диапазоне от 1,0% до 2,5% в течение 8-недельного периода мечения10, как показано на рисунке 2. В предыдущем исследовании использовался протокол мечения 2H2O для оценки кинетики жировой ткани путем включения 2H в ДНК жировых клеток, как подробно описано в разделах 2-8, и сообщалось, что in vivo

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Оценки in vivo необходимы для получения новых знаний о динамике оборота белой АТ и ее роли в ожирении и связанных с ним метаболических заболеваниях, поскольку оценки in vitro не охватывают естественную среду АТ. Несмотря на то, что использование ретроспективного радиоуглеродного датирования для оценки динамики жировой ткани оказалось информативным 7,25, этот подход не подходит для фиксации динамических изменений...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы благодарят Центр масс-спектрометрии в Пеннингтонском биомедицинском исследовательском центре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-метилимидазолMilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Уксусный ангидридОлдридж539996
ACK Лизирующий буфер (буфер для лизиса эритроцитов)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1)Биотин Инвитроген13-0319-82
Античеловеческий CD34 БиотинИнвитроген13-0349-82
Античеловеческий CD45BioLegend304004
антибиотик Антимикотический растворMilliporeSigmaA5955
Коллагеназа типа 1Worthington Biochemical КорпорацияLS004196
Дезоксирибоза (2-дезоксид-рибоза)MilliporeSigma31170
Оксид дейтерияMilliporeSigma756822
колонка DB-225 (30м, 0.25мм, 0.25мкм)J& W Scientific122-2232
Дихлорметан (DCM)MilliporeSigma34856
Стандарт ДНК (ДНК тимуса теленка)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (набор для экстракции ДНК)Qiagen69504
Easy Sep Набор биотина человекаТехнологии стволовых клеток17663
EasySep Положительный отбор CD14 человека Технологии коктейльныхстволовых клеток18058C
ЭтилацетатFisherEX0241-1
Falcon 5 мл Круглое дно Полистирольная пробиркаVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC флаконы (2 мл)FisherC-4011-1W
GC флаконы вкладышиFisherС-4011-631; C-4012-530
Ледяная уксусная кислотаFisherAC14893-0010
Стеклянные трубки (для гидролиза)Fisher14-959-35AA
Буфер HEPESThermoFisher15630080
Hyclone Water, молекулярная биология классаThomas ScientificSH30538.02
MEM alphaFisher Scientific32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-пенатфторбензилгидроксиламина гидрохлоридИндикаторные полоски MilliporeSigma194484
pH,Fisher987618
Фосфатазная кислотаCalbiochem (VWR)80602-592
S1 нуклеаза (из Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
Сульфат натрияMilliporeSigma23913
)

Ссылки

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.