С момента появления детекторов прямых электронов и совершенствования программного и аппаратного обеспечения криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала методом, который позволяет исследователям регулярно определять структуру макромолекул с точностью до 1,2 единицы. Катализатором этого ускорения стал ряд чрезвычайно быстрых разработок, от пробоподготовки до сбора и обработки данных. Чтобы обеспечить широкую демократизацию этого метода для неспециалистов, были созданы более эффективные и доступные конвейеры. Поразительно, но менее чем через 10 лет после «революции разрешения» крио-ЭМ стала важным методом для определения характеристик белков, как в академических кругах, так ив промышленности.
Одним из наиболее примечательных аспектов исследовательского сообщества крио-ЭМ является готовность открыто делиться протоколами, стратегиями и программнымобеспечением. Такая открытость технологий и опыта в значительной степени способствовала очень быстрым темпам разработки, но некоторые узкие места по-прежнему не позволяют сделать ее полностью доступной. В этой коллекции методов мы стремимся описать некоторые из последних разработок в области подготовки сеток, пригодных для структурного анализа с помощью крио-ЭМ, что, наряду с доступом к оборудованию для анализа данных, является основным узким местом для многих проектов. Мы также обсуждаем новые протоколы, которые в настоящее время разрабатываются в этой области, для новых подходов в крио-ЭМ анализе.
Как было сказано выше, одним из текущих узких мест для рутинного применения крио-ЭМ в лаборатории является пробоподготовка. На уровне нанесения образца на сетки может возникнуть несколько проблем: чаще всего это предпочтительная ориентация образца во льду и его денатурация на границе раздела воздух-вода. Одним из решений этой проблемы является экранирование образца от границы раздела воздух-вода с помощью вспомогательных пленок из углерода или графена, которые физически предотвращают контакт образца с воздухом. Чтобы облегчить нанесение тонких пленок на сетки, де Мартин Гарридо и др.6 разработали поддерживающий флоатинговый блок, изготовленный на 3D-принтере, который позволяет наносить небольшие капли воды и образец контролируемым образом. С помощью этого блока слои графена и углерода наносятся недорогим и удобным для пользователя способом.
Еще один способ предотвратить повреждение на границе раздела воздух-вода — ограничить время, в течение которого белок подвергается воздействию атмосферы. Для этого два разных инструмента, разработанные Klebs et al.7 и Budell et al.8, используют новые подходы для быстрой (всего за 10 мс) подготовки сетки, снижая вероятность проблем с ориентацией частиц. Еще одним преимуществом этих устройств является возможность проведения экспериментов с временным разрешением, что является новым захватывающим рубежом для структурных исследований.
В противоположном подходе Нгуен и др.9 сообщают о методе замораживания сеток для крио-ЭМ анализа в отсутствие коммерческих или изготовленных на заказ устройств, которые либо очень дороги, либо сложны в изготовлении. Они показывают, как можно получить сетки аналогичного качества с помощью дешевого самодельного устройства, не требующего дорогостоящих приборов, что способствует демократизации крио-ЭМ.
В крио-ЭМ исследуемый образец не всегда является белком, а может быть небольшой молекулой или большой биологической системой, такой как целая клетка. Подготовка таких образцов уникальна, и требует определенных шагов, а также различных стратегий в сборе данных.
Для микрокристаллической дифракции электронов (MicroED) исследуемый образец представляет собой небольшое химическое вещество, которое обычно встречается в виде порошка. Порошок наносится непосредственно на электромагнитную сетку для поддержания кристаллической формы. Затем сбор данных выполняется в дифракционном режиме, как показано Мартиновичем и Гоненом10. Напротив, целые клетки слишком толстые для крио-ЭМ анализа. Чтобы решить эту проблему, Bisson et al. сообщают о методе использования СЭМ для физического бурения в таком образце с целью получения тонких срезов, пригодных для структурныхисследований.
От образца до структуры важно вести учет каждого этапа процесса, так как для каждого образца белка изменяется множество параметров, от концентрации белка до настроек микроскопа и анализа данных. С этой целью Wypych et al.12 разработали веб-инструмент управления информацией, который позволяет пользователям организовывать свой рабочий процесс и отслеживать все детали, необходимые для будущих публикаций. Это особенно важно, поскольку автоматизация становится все более и более распространенной в крио-ЭМ, особенно в промышленных условиях.
За последнее десятилетие Cryo-EM развивалась выдающимися темпами, как в аппаратном, так и в программном обеспечении. Для обеспечения широкого распространения передового опыта и широкого внедрения новых методов необходим прозрачный набор протоколов. Этот специальный выпуск будет способствовать этим усилиям.