Методическая статья

Выделение и транскриптомный анализ типов растительных клеток

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 апреля 2023 г.

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Осуществимость и эффективность высокопроизводительных методов секвенирования скРНК предвещают эру одноклеточных исследований растений. Здесь представлена надежная и полная процедура выделения конкретных типов клеток корня Arabidopsis thaliana и последующего построения и анализа библиотеки транскриптома.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В многоклеточных организмах программирование развития и реакции окружающей среды могут сильно различаться в разных типах клеток или даже внутри клеток, что известно как клеточная гетерогенность. В последние годы выделение отдельных клеток и клеток в сочетании с методами секвенирования следующего поколения (NGS) стали важными инструментами для изучения биологических процессов при разрешении в одной клетке. Однако выделение растительных клеток относительно сложнее из-за наличия клеточных стенок растений, что ограничивает применение одноклеточных подходов у растений. Этот протокол описывает надежную процедуру выделения одноклеточных и клеточных клеток на основе флуоресцентно-активированной сортировки (FACS) с растительными клетками, которая подходит для последующего мультиомиксного анализа и других исследований. Используя флуоресцентные маркерные линии корня арабидопсиса , мы демонстрируем, как выделяются определенные типы клеток, такие как клетки перицикла ксилемы, начальные клетки латерального корня, клетки боковой крышки корня, клетки коры и энтодермальные клетки. Кроме того, предусмотрен эффективный последующий метод анализа транскриптома с использованием Smart-seq2. Метод выделения клеток и методы анализа транскриптома могут быть адаптированы к другим типам клеток и видам растений и имеют широкий потенциал применения в науке о растениях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки являются основной единицей всех живых организмов и выполняют структурные и физиологические функции. Хотя клетки в многоклеточных организмах демонстрируют кажущуюся синхронность, клетки разных типов и отдельные клетки демонстрируют различия в своих транскриптомах во время развития и реакций окружающей среды. Высокопроизводительное секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) обеспечивает беспрецедентную мощность для понимания клеточной гетерогенности. Применение scRNA-seq в науках о растениях способствовало успешному построению атласарастительных клеток 1, использовалось для идентификации редких клеточных таксонов в тканях растений2, дало представление о составе типов клеток в тканях растений и использовалось для идентификации клеточной идентичности и важных функций, используемых во время развития и дифференцировки растений. Кроме того, можно вывести пространственно-временные траектории развития в тканях растений 1,2,3, открыть новые гены-маркеры 4 и изучить функции важных факторов транскрипции5 с помощью scRNA-seq, чтобы выявить эволюционное сохранение одного и того же типа клеток у разных растений 3. Абиотические стрессы являются одними из наиболее важных факторов воздействия окружающей среды на рост и развитие растений. Исследуя изменения в составе типов клеток в тканях растений в различных условиях лечения с помощью секвенирования одноклеточного транскриптома, можно также разрешить механизм абиотической реакциина стресс 6.

Потенциал разрешения транскрипционной гетерогенности между типами клеток с использованием секвенирования скРНК зависит от метода выделения клеток и платформы секвенирования. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS), является широко используемым методом выделения субпопуляции клеток для scRNA-seq на основе рассеяния света и флуоресцентных свойств клеток. Разработка флуоресцентных маркерных линий с помощью трансгенной технологии значительно повысила эффективность выделения клеток с помощью FACS7. Проведение секвенирования скРНК с использованием Smart-seq28 еще больше усиливает способность препарировать клеточную гетерогенность. Метод Smart-seq2 обладает хорошей чувствительностью для детекции генов и может обнаруживать гены даже при низком входе транскрипта9. В дополнение к массовому сбору типов клеток, современные сортировщики клеток предоставляют формат сортировки индекса одной ячейки, что позволяет проводить анализ транскриптома с разрешением одной клетки с использованием Smart-seq210 или других мультиплексных методов секвенирования РНК, таких как CEL-seq211. Сортировка по одной ячейке или по ячейке потенциально может быть использована для многих других последующих приложений, таких как параллельные мультиомические исследования12,13. Здесь представлен надежный и универсальный протокол для выделения типов растительных клеток, таких как клетки перицикла ксилемы, клетки боковой корневой крышки, начальные клетки бокового корня, клетки коры и энтодермальные клетки из корней маркерных клеточных линий Arabidopsis thaliana с помощью FACS. Кроме того, протокол включает в себя создание библиотеки Smart-seq2 для последующего анализа транскриптома.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол был оптимизирован для семян дикого типа (WT) A. thaliana без флуоресцентных и флуоресцентных маркерных линий для следующих типов корневых клеток: клетки перицикла ксилемы-полюса (J0121), начальные клетки бокового корня, клетки боковой корневой крышки (J3411), клетки энтодермы и коры (J0571) (рис. 1A). Все маркерные линии были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов), за исключением маркерной линии клеток инициации бокового корня, которая была получена путем введения конструкции GFP, управляемой промотором GATA23, в растение Arabidopsis дикого типа в соответствии с ранее опубликованным отчетом14.

1. Подготовка растительного сырья

  1. Стерилизуют семена A. thaliana WT и семена флуоресцентной маркерной линии, инкубируя семена в 20% отбеливателе во вращающемся инкубаторе при комнатной температуре в течение 15 минут.
  2. Промойте семена в воде двойной дистилляции (ddH2O) от трех до пяти раз. Выполните этот шаг на стерильной чистой скамье.
  3. Нанесите семена WT и репортерной линии на среднюю средность Murashige и Skoog (MS) половинной крепости с 0,8% агара (мас./об.)15. Выращивайте растения вертикально в течение 5 дней (16 часов света при 23 ° C) после стратификации в течение 2 дней при 4 ° C.

2. Протопластинг

  1. Приготовьте протопластные растворы2,5, называемые раствором А и раствором В (см. Таблицу материалов).
    1. Приготовьте раствор А, содержащий 400 мМ маннита, 0,05% BSA, 20 мМ MES (рН 5,7), 10 мМ CaCl2 и 20 мМ KCl (см. Таблицу материалов). Храните раствор А при температуре −20 °C до 1 месяца.
    2. Приготовьте раствор B, добавив 1% (мас./об.) целлюлазы R10, 1% (мас./об.) целлюлазы RS, 1% (мас./об.) гемицеллюлазы, 0,5% (мас./об.) пектолиазы и 1% (мас./об.) мацероцима R10 в свежей аликвоте раствора А. Храните раствор B при -20 °C до 1 месяца.
  2. Аккуратно разморозьте раствор А и раствор Б на льду перед началом эксперимента.
  3. Срежьте корни чистым лезвием или ножницами и измельчите корни на кусочки ~0,5 см. Погрузите корни в 1,5 мл раствора B с последующим осторожным вращением (примерно при 18 об/мин) при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов.
  4. Отфильтруйте корневые протопласты через сетчатый фильтр 40 мкм (см. Таблицу материалов).
  5. Промойте сетку сетчатого фильтра 1-2 мл раствора А.
  6. Смешайте жидкости на шагах 2.4 и 2.5 и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, ресуспендируйте клеточную гранулу в 500-600 мкл раствора А, а затем немедленно поместите ее на лед.
  7. Перенесите ресуспендированный клеточный раствор в новую пробирку объемом 5 мл для сортировки клеток.

3. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS)

  1. Включите и завершите шаги настройки прибора на сортировщике (см. Таблицу материалов). Выберите флуоресцентные каналы, используйте установку WT (без флуоресценции) в качестве элемента управления, чтобы определить базовую линию для автофлуоресценции, и отрегулируйте сортировочный затвор в зависимости от интенсивности флуоресценции и синглетов FSC/SSC (рис. 2).
  2. Добавьте 500 мкл раствора А (этап 2.1.1) в пробирку для сбора объемом 1,5 мл, чтобы предотвратить повреждение клеток. Соберите 2 000-3 000 клеток в пробирке.
  3. После сортировки немедленно поместите образцы на лед, центрифугируйте сборную пробирку, содержащую клетки при 300 x g , в течение 5 мин при 4 ° C и удалите надосадочную жидкость пипеткой.
  4. Возьмите 2 мкл отсортированных клеток и проверьте наличие флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
  5. Храните отсортированные ячейки при температуре −80 °C или сразу же используйте их для создания библиотеки (шаг 4).
  6. Для сортировки индекса по одной ячейке поместите пластину с 96 лунками в адаптер. Откалибруйте положение пластины так, чтобы капля попадала в центральное отверстие пластины. Выберите режим сортировки по одной ячейке при сортировке, введите целевое количество отсортированных ячеек равным 1 и начните сортировку.

4. Подготовка библиотеки Smart-seq2

  1. В результате сверхмалого количества входных данных выполните построение библиотеки РНК-секвенирования одноклеточного типа в среде, свободной от загрязнения. Перед началом эксперимента очистите стенд поверхностным обеззараживающим средством8 (см. Таблицу материалов) и 75% этанолом.
  2. Приготовьте буфер для лизиса (смесь А) (таблица 1), объединив 0,33 мкл 10% Triton X-100, 0,55 мкл ингибитора РНКазы и 0,22 мкл 0,1 М DTT (см. Таблицу материалов).
  3. Добавьте 1 мкл смеси А в отсортированный образец и измельчите стерильным пестиком. Предпочтительный объем образца составляет ≤0,5 мкл; используйте воду, не содержащую РНКазы, чтобы восполнить объем до 14 мкл. Перенесите каждый образец клетки в тонкостенную пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл.
  4. Приготовьте смесь B, содержащую 0,44 мкл реакционного праймера с обратной транскрипцией (RT) oligo-dT 30 VN (100 мкМ) и 4,4 мкл dNTP (10мМ) (таблица 2) (см. Таблицу материалов).
  5. Добавьте 4,4 мкл смеси B к 14 мкл образца в каждой пробирке, аккуратно перемешайте образец пипеткой и инкубируйте образец при 72 ° C в течение 3 минут. После инкубации немедленно поместите образцы на лед, чтобы гибридизировать олиго-dT с поли-А-хвостом.
  6. Приготовьте реакционную смесь обратной транскрипции (смесь С) (табл. 3) (см. Таблицу материалов). Добавьте 21,6 мкл смеси С в каждую пробирку, содержащую образцы. Включите программу ЛТ на обычном ПЦР-приборе (табл. 4).
  7. Проведите реакцию предварительного усиления на льду. Приготовьте смесь D, соединив 44 мкл смеси 2x ПЦР-полимеразы и 0,88 мкл праймера IS PCR (10 мкМ) (таблица 5) (см. Таблицу материалов). Добавьте 40,8 мкл смеси D к 40 мкл продукта реакции RT и запустите программу предварительного усиления (таблица 6).
  8. Очистите продукты реакции предварительного усиления с помощью гранул Ampure XP (см. Таблицу материалов). Добавьте 48 мкл шариков (соотношение 0,6:1) в каждый образец с шага 4.7 и аккуратно перемешайте образцы с помощью пипетки.
  9. Инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 10 мин. Поместите пробирки объемом 1,5 мл с образцами на стенд для магнитной сепарации на 5 минут. Аккуратно сбрасывайте надосадочную жидкость с образцов, не повреждая бусины.
  10. Промойте шарики, ресуспендировав их в 200 мкл 80% этанола, и поместите образцы на стенд для магнитной сепарации (см. Таблицу материалов) еще на 3 минуты, прежде чем выбросить надосадочную жидкость, содержащую этанол.
  11. Высушите образцы на воздухе в течение 10 минут и накройте пробирку, чтобы предотвратить загрязнение и перекрестное загрязнение во время сушки на воздухе.
  12. Ресуспендируют шарики в 20 мкл ddH2O, инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем помещают их на стенд для магнитной сепарации на 5 мин.
  13. Пипеткой вынимают 18 мкл надосадочной жидкости из каждой пробирки и переносят образцы в новые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Используйте 1 мкл образца для оценки качества кДНК с помощью набора для количественного определения ДНК, определите распределение по размерам каждой предварительной библиотеки с помощью анализатора фрагментов (см. Таблицу материалов) и храните оставшийся образец при -20 ° C.
  14. Создайте библиотекукДНК 8 для секвенированияIllumina 16 из предбиблиотечного продукта шага 4.13, используя набор для подготовки библиотеки секвенирования (см. Таблицу материалов).
  15. Очистите библиотеки (из шага 4.14) с помощью шариков Ampure XP, количественно определите очищенные библиотеки и определите распределение размеров каждой библиотеки после шага 4.13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините равные наномоли каждой библиотеки, убедившись, что ни один из них не имеет одинаковой комбинации индекса Illumina. В противном случае библиотеки могут быть объединены в соотношение, основанное на желаемом выходе секвенирования, и секвенированы вместе на одной полосе секвенсора Illumina. Как правило, секвенирование каждой библиотеки на глубину 4-6 ГБ, что дает >10 миллионов картированных чтений, обеспечивает 20-30-кратный охват генома Arabidopsis . Меньшая глубина секвенирования также приемлема, но может повлиять на значимость анализа дифференциального выражения.

5. Анализ данных RNA-seq

  1. Обрежьте необработанные чтения с помощью Trim-Galore17 с последующим сопоставлением с эталонным геномом с помощью hisat218 (daehwankimlab.github.io/hisat2) и удалите дублированные фрагменты ПЦР с помощью Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. Проведите обработку необработанного подсчета и последующий анализ дифференциально экспрессируемых генов (DEG) с помощью DESeq220 , используя по крайней мере три биологические реплики для каждого образца. Выполните кластеризацию экспрессии генов с помощью пакета Pheatmap и визуализируйте тепловую карту экспрессии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения RPKM (чтений на килобазу на миллион картированных чтений) генов и TE (переносимых элементов) были рассчитаны с помощью Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) и визуализированы в браузере генома.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляция протопласта
Этот протокол эффективен для сортировки протопластов флуоресцентных линий корневых маркеров A. thaliana. Эти маркерные линии были разработаны путем слияния флуоресцентных белков с генами, экспрессируемыми специфически в типах клеток-мишеней, или с использованием линий-ловушек энхансеров (рис. 1). Многочисленные ткани и органы были расчленены на типы клеток, экспрессирующие специфические флуоресцентные маркеры в модельных растениях и сельскохо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол на основе Smart-seq2 может генерировать надежные библиотеки секвенирования из нескольких сотен ячеек8. Качество исходного материала имеет важное значение для точности анализа транскриптома. FACS является мощным инструментом для подготовки клеток, представляющих интерес, но эта процедура, особенно этап протопластинга, должна быть оптимизирована для применения в растениях. Лазерная захватная микродиссекция (LCM) или ручная рассеченная клетка также может быть использована в качестве входных<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы создали этот протокол в одноклеточном мультиомиксном центре Школы сельского хозяйства и биологии Шанхайского университета Цзяотун при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 32070608), Шанхайской программы Пуцзян (грант No 20PJ1405800) и Шанхайского университета Цзяотун (грант No Agri-X20200202, 2019TPB05).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m ситечкоSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Анализатор фрагментов AgilentAglient5200
Agilent высокочувствительный набор ДНКAglientDNF-474-0500
Ampure XP бусиныBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
ОтбеливательMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) отбеливатель
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Целлюлаза R10Yakult (Япония)9012-54-8
Целлюлаза RSYakult (Япония)9012-54-8
Центрифужная пробирка (1,5 мл)Eppendolf30121589
ДНКаза, РНКаза, ДНК и РНК обеззараживающие поверхностные деконтаминантыBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)
инвитроген		18090050
этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Фильтр tip  (1000 & микро; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
  (200 & микро; L)Фильтрующий наконечник Thermo ScientificTF140-200-Q
(10 & микро; L)Фильтрующий наконечник Thermo ScientificTF104-10-Q
(100 &; L)TF113-100-Q
Eclipse Ni-E
четырехмерный вращающийся смесительKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR праймер5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Япония)9032-75-1
Стенд магнитной сепарацииinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
МикроцентрифугаEppendorfCentrifuge 5425
Микро-мини-центрифугаTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT Набор для подготовки библиотеки ДНКilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN праймер5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
приборТермоамплификаторA24811
ПектолиазаYakult (Япония)9033-35-6
Маркерные линии растенийNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Флуориметр Qubit 2.0инвитрогенQ32866
ингибитор РНКазы Thermo ScientificEO0382
РНКаза водныйинвитроген10977023
раствор A400 мМ маннитол, 0,05 % BSA, 20 мМ MES (pH5,7), 10 мМ CaCl<суб>2, 20 мМ KCl
раствор B1 % (w/v) целлюлаза R10, 1 % (w/v) целлюлаза RS, 1 %  (w/v)гемицеллюлаза, 0,5 %  (w/v)пектолиаза и 1 %  (б/в) Мацерозим R10 в свежей аликвоте раствора
А Стерильный пестикBIOTREAT453463
Ситечко (40 & микро; m )Sorfa 251100
Обратная транскриптаза SuperScript IV (200 U/µ L)invitrogen18090050
SuperScript IV буфер (5x)invitrogen18090050
пробирки (5 мл)BD Falcon352052
Тонкостенные ПЦР-пробирки с крышками (0,5 мл)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO праймер5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
Наконечник фильтра Флуоресцентный микроскоп Thermo Scientific Nikon 7958935001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ArabidopsisSmart seq2

Похожие статьи