Method Article

Протокол построения модели раны крысы при сахарном диабете 1 типа

DOI:

10.3791/64914

⸱

February 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Nursing, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированная стрептозотоцином модель диабетической раны у самцов крыс SD в настоящее время является наиболее широко используемой моделью для изучения заживления ран при сахарном диабете I типа. В этом протоколе описываются методы, используемые для построения этой модели. Он также представляет и решает потенциальные проблемы и исследует прогрессирование и ангиогенные характеристики диабетических ран.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Однократная инъекция стрептозотоцина в высокой дозе с последующим иссечением кожи на всю толщину спины крыс является распространенным методом построения животных моделей диабетических ран 1 типа. Однако неправильные манипуляции могут привести к нестабильности модели и высокой смертности у крыс. К сожалению, существует несколько существующих руководств по моделированию диабетических ран 1 типа, и им не хватает деталей и не представлены конкретные эталонные стратегии. Таким образом, в этом протоколе подробно описывается полная процедура построения модели диабетической раны 1 типа и анализируются прогрессирование и ангиогенные характеристики диабетических ран. Моделирование диабетической раны 1 типа включает в себя следующие этапы: подготовка инъекции стрептозотоцина, индукция сахарного диабета 1 типа и построение модели раны. Площадь раны измеряли на 7-й и 14-й день после ранения, а кожные ткани крыс извлекали для гистопатологического и иммунофлюоресцентного анализа. Результаты показали, что сахарный диабет 1 типа, вызванный стрептозотоцином 55 мг / кг, был связан с более низкой смертностью и высокой вероятностью успеха. Уровень глюкозы в крови был относительно стабильным после 5 недель индукции. Скорость заживления диабетических ран была значительно ниже, чем у нормальных ран на 7-й и 14-й день (p < 0,05), но оба могли достигать более 90% на 14-й день. По сравнению с нормальной группой, закрытие эпидермального слоя диабетических ран на 14-е сутки было неполным и имело замедленную реэпителизацию и достоверно более низкий ангиогенез (p < 0,01). Модель диабетической раны 1 типа, построенная на основе этого протокола, имеет характеристики хронического заживления ран, включая плохое закрытие, отсроченную реэпителизацию и снижение ангиогенеза по сравнению с нормальными ранами крыс.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – хроническое заболевание обмена веществ, характеризующееся гипергликемией и разрушением β-клеток поджелудочной железы1. Рана СД1 является хронической незаживающей раной и наиболее частым и разрушительным осложнением сахарного диабета у человека 2,3. Животные модели являются наиболее подходящими прототипами для изучения патологических изменений во время заживления ран, а также безопасности и эффективности потенциальных терапевтических агентов4. По сравнению с другими типами, самцы крыс Sprague-Dawley (SD) более чувствительны к стрептозотоцину (STZ) и демонстрируют более низкий уровень смертности, что делает их популярными в исследованиях диабетических ран 5,6.

Описаны многочисленные методы построения моделей ран СД1. Что касается модели СД1, исследования в основном были сосредоточены на влиянии метода инъекций STZ на успешность индукции диабета 7,8. Однако процесс моделирования страдает от непоследовательного выполнения этого же шага. В одном исследовании крысы голодали в течение 18 часов перед инъекцией STZ; крысы с уровнем глюкозы в крови выше 16,67 ммоль / л через 1 неделю после инъекции STZ были признаны диабетиками, и диабетическая рана была введена через 3 недели9. И наоборот, в соответствующем исследовании Zhu et al. голодали крысам в течение 12 часов перед инъекцией STZ; крысы с уровнем глюкозы в крови выше 16,7 ммоль/л через 72 ч после инъекции считались диабетиками, и диабетическая рана вводилась через 4 недели10. В целом, существуют несоответствия в протоколах инъекций STZ, критериях диагностики диабета и времени введения в рану.

С точки зрения моделирования раны, в большинстве исследований иссекается вся толщина дорсальной кожи для построения ран СД1 после успешной индукции диабета11,12,13. Хотя эта модель подвержена кожной контрактуре у крыс, она является наиболее часто используемой моделью в исследованиях заживления ран, поскольку она менее трудоемка и дешева14,15. Тем не менее, методические исследования этого метода иссечения на всю толщину отсутствуют. Кроме того, в существующих исследованиях нет единых стандартов относительно размера и расположения раны12,16. Размер и расположение раны могут косвенно влиять на согласованность плана эксперимента и научную обоснованность результатов. Поэтому существует острая необходимость в стандартном протоколе индукции СД1 и моделирования ран в качестве справочного материала для исследователей. Целью данного исследования является визуализация конкретного протокола моделирования ран СД1, который может быть использован в качестве эталона для исследований ран СД1.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был проведен в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все эксперименты на животных были одобрены Управляющим комитетом Университета традиционной китайской медицины Чэнду (запись No 2021-13).

1. Подготовка инъекции стрептозотоцина

  1. Выберите 15 самцов SD крыс, не содержащих патогенов (SPF), в возрасте 8 недель и весом 220 г ± 20 г. Используя простой метод рандомизации, разделите крыс на группу диабетиков (n = 10) и нормальную группу (n = 5).
  2. Измерьте начальный вес крыс и определите дозировку STZ путем введения 55 мг / кг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на предварительных экспериментах, 55 мг / кг является оптимальной дозой STZ.
  3. Точно взвесьте порошок STZ и поместите его в светонепроницаемый контейнер.
  4. Добавьте соответствующее количество 0,1 моль/л буфера цитрата натрия (рН 4,5) для растворения STZ до концентрации 1%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием буфер цитрата натрия необходимо предварительно охладить в течение 2 часов в холодильнике с температурой 4 °C. Приготовление раствора СТЗ должно обеспечивать стерильность.
  5. Встряхните в течение 30 с с помощью лекарственного осциллятора. Поместите в ящик для льда и отложите в сторону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекцию следует использовать в течение 15 минут.

2. Индукция модели T1DM

  1. Перед инъекцией STZ разговите крыс в течение 18 часов и обеспечьте свободный доступ к воде.
  2. Проводят внутрибрюшинную инъекцию 1% раствора СТЗ.
    1. Возьмите крысу и обнажьте кожу живота и место инъекции (пересечение линии, соединяющей корни двух бедер и среднюю линию живота).
    2. Дважды продезинфицируйте место инъекции ватным тампоном, смоченным в 75% спирте (один раз по часовой стрелке и один раз против часовой стрелки). Поместите голову крысы ниже брюшка.
    3. Введите иглу параллельно средней линии живота под углом 45°, а после прокалывания кожи уменьшите угол иглы до 30°, а затем введите иглу на 2-3 мм. Осторожно потяните за игольчатую пробку, следя за тем, чтобы в шприц не всасывалась кровь или жидкость. Введите раствор СТЗ, вытащите иглу и остановите кровотечение ватным тампоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если желтая жидкость втягивается обратно в шприц, игла могла проникнуть в мочевой пузырь, а если втягивается темно-зеленая жидкость, игла могла проникнуть в толстую кишку или слепую кишку. В любом случае иглу следует немедленно извлечь. Животное должно быть оценено ветеринарным персоналом.
  3. Измерьте случайный (не натощак или натощак) уровень глюкозы в крови в 09:00 утра на 3-й день и 7-й день после индукции STZ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время для случайного измерения уровня глюкозы в крови фиксировано. В этом протоколе он зафиксирован в 09:00 утра. Однако это не единственное используемое время. Кровь, собранная из каудальной вены с помощью пункции иглой, менее восприимчива к тканевой жидкости, чем кровь, взятая из отрубленного хвоста, поэтому значения глюкозы в крови более точны.
    1. Обездвижите крысу с помощью фиксатора крысы (рис. 1).
    2. Найдите расположение каудальной вены. Дважды продезинфицируйте хвост крысы, используя ватный тампон, смоченный в 75% спирте.
    3. Проколите каудальную вену, чтобы вызвать кровотечение, и измерьте уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра. Остановите кровотечение ватным тампоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень глюкозы выше 16,7 ммоль/л на 7-й день после инъекции STZ считается СД1.
  4. Еженедельно взвешивайте крыс и измеряйте уровень глюкозы в крови и другие параметры, включая диету, потребление воды и диурез.
  5. Кормите животных нормально в течение 8 недель после индукции STZ.

3. Построение модели раны

  1. Побрейте крыс электробритвой за 1 день до моделирования раны. Выбритая область 5 см х 5 см на спинной стороне крысы, как правило, идеальна.
  2. Протрите бритый участок теплым ватным тампоном с физиологическим раствором, дайте ему высохнуть, а затем нанесите крем для депиляции на 5 минут. Очистите область марлей и смойте остатки крема для депиляции теплым физиологическим раствором.
  3. Взвесьте крыс и рассчитайте необходимую дозу нембутала на основе стандарта 35 мг / кг. Растворите нембутал с помощью обычного физиологического раствора до концентрации 3%. Для этой процедуры можно использовать другие общие анестетики, такие как кетамин / ксилазин или изофлуран. Пожалуйста, работайте с институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию, чтобы убедиться, что лучше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эффективности раствор должен быть свежеприготовленным, а порошок и раствор нембутала должны быть защищены от света.
  4. Голодают крысам в течение 12 ч до анестезии. Вводят анестезию внутрибрюшинно. Используйте тетрациклиновую глазную мазь или общую смазку для глаз, чтобы предотвратить сухость глаз после введения анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия считалась умеренной, когда мышцы крысы были относительно расслаблены, движения глаз исчезли, дыхание было регулярным, а реакция на болевые раздражители была небольшой.
  5. Дважды продезинфицируйте кожу спины, используя ватные тампоны, смоченные йодом (один раз по часовой стрелке и один раз против часовой стрелки) и 75% спиртом (альтернативные раунды).
  6. После высыхания срежьте кожу круговым биопсийным пуансоном диаметром 20 мм.
  7. Наложите палатку на кожу стерильными щипцами, а затем с помощью стерильных хирургических ножниц удалите кожу на всю толщину вдоль следов порезов. Остановите кровотечение с помощью обычного солевого ватного тампона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя граница раны должна быть на 5-10 мм ниже нижней границы лопатки и на 5-10 мм справа/слева от позвоночника крысы (рис. 2). Раны симметричны вдоль позвоночника, когда строятся две раны.
  8. Используйте вазелиновую марлю, чтобы покрыть раны, и оберните их марлей и дышащей повязкой, удерживаемой на месте резиновой лентой. Вводите карпрофен подкожно (5 мг / кг) один раз в день для облегчения послеоперационной боли. Меняйте повязку на рану один раз в день (использование карпрофена для обезболивания).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за движением и дыханием крысы на предмет любых отклонений после наложения повязки и убедитесь, что дышащая повязка достаточно плотная.
  9. Поместите линейку под рану и фотографируйте рану цифровой камерой до 14-го дня. Усыпьте крыс на 14-й день в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и их использованию. Разрежьте рану кожной тканью на расстоянии 5 мм от края раны. Разделите образец ткани на две части, промойте их PBS для удаления видимых пятен крови, а затем зафиксируйте 4% раствором параформальдегида.

4. Расчет площади раны с помощью программного обеспечения ImageJ

  1. Нажмите кнопку « Файл » после открытия программного обеспечения, а затем раскройте и нажмите « Открыть », чтобы открыть раневые изображения.
  2. Выберите инструмент «Прямые » и нарисуйте прямую линию длиной 1 см вдоль линейки на рисунках раны.
  3. Нажмите на команду « Установить масштаб » в меню « Анализ » и установите для параметра «Известное расстояние » значение 1.
  4. Выберите инструмент « Выделение от руки » и нарисуйте контур раны на рисунке.
  5. Нажмите на команду « Измерить » в меню « Анализ» и прочтите значение «Площадь » после того, как появится результат.

5. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Извлеките кожную ткань из фиксатора, разрежьте ее на тонкие срезы скальпелем в вытяжном шкафу и поместите в кассету для обезвоживания.
  2. Поместите кассету для обезвоживания в дегидратационную машину и обезвоживайте ткани в следующие этапы: 75% спирт в течение 4 часов; 85% спирт в течение 2 ч; 90% спирт в течение 2 ч; 95% спирт в течение 1 ч; безводный этанол I и II по 30 мин каждый; спиртобензол в течение 5-10 мин; ксилол I и II по 5-10 мин; и воск I, II и III по 1 часу.
  3. Встройте салфетки в воск. Охладите при температуре −20° на морозильном столе и аккуратно поправьте восковой блок.
  4. Разрежьте восковые блоки в продольном направлении с помощью парафиновой секционной машины на участки толщиной 3 мкм.
  5. Последовательно замочите срез в ксилоле I и II на 20 мин каждый, безводном этаноле I и II на 5 мин каждый, водопроводной воде на 5 мин.
  6. Залить ткани гематоксилином в течение 3-5 мин, дифференцировать 0,5% водный раствор соляной кислоты, 0,5% водный раствор аммиака обратно до синего цвета и промыть водой.
  7. Обезвоживайте участки тканей 85% и 95% спиртом. Залить ткани раствором для окрашивания эозином на 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно окрашивание эозином занимает от 30 до 2 минут, и время может быть скорректировано в соответствии с результатами окрашивания и требованиями.
  8. Последовательно обезвоживают срезы следующими растворами: безводный этанол I, безводный этанол II, безводный этанол III, ксилол I и ксилол II каждый в течение 5 мин. Наконец, покройте предметные стекла нейтральным бальзамом.
  9. Исследуйте ткани, окрашенные H&E, под микроскопом в 40, 20 и 10 раз и сделайте снимки, чтобы сохранить репрезентативные изображения каждого предметного стекла.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31

  1. Замочите срезы тканей в ксилоле I и II на 15 мин каждый, безводном этаноле I и II на 5 мин каждый, 85% спирте на 5 мин и 75% спирте на 5 мин и промойте дистиллированной водой.
  2. Репарация антигена
    1. Добавьте подходящий буфер лимонной кислоты 10 мМ с pH 6,0 в емкость микроволновой печи, нагрейте его до кипения на сильном огне, а затем поместите в него предметное стекло.
    2. Кипятить 8 мин на среднем огне, остановиться на 8 мин, а затем снова кипятить на среднем или слабом огне в течение 7 мин.
    3. Дайте предметным стеклам остыть, поместите их в PBS (pH 7,4) и промойте три раза по 5 минут каждый с помощью шейкера для обесцвечивания.
  3. Добавьте 5% козьей сыворотки по каплям в круг и выдерживайте в течение 30 минут.
  4. Аккуратно стряхните укупорочный раствор (5% козью сыворотку) и добавьте антитело кролика против CD31 (разбавленное с помощью PBS в соотношении 1:200) по каплям на срезы. Поместите срезы во влажный ящик и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C.
  5. Промойте предметные стекла три раза PBS (pH 7,4) на шейкере для обесцвечивания в течение 5 минут каждый. Слегка встряхните срезы, чтобы высушить их, а затем покройте их круговой каплей козьего антикроличьего IgG с маркировкой FITC. Инкубировать при комнатной температуре в течение 50 минут в темноте.
  6. Промойте предметные стекла три раза PBS (pH 7,4) на шейкере для обесцвечивания в течение 5 минут каждый. Высушите срезы на воздухе легким встряхиванием и добавьте окрашивающий раствор DAPI. Выдержите срезы в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  7. После высыхания срезов нарисуйте круги вокруг ткани с помощью PepPen (чтобы предотвратить потерю антител), добавьте к кругам гасящий автофлуоресценцию агент (0,3% Sudan Black B) в течение 5 мин, а затем промойте их под проточной водой в течение 10 мин.
  8. Промойте предметные стекла три раза PBS (pH 7,4) на шейкере для обесцвечивания в течение 5 минут каждый. Слегка встряхните секции и загерметизируйте их монтажной средой с защитой от выцветания.
  9. Наблюдайте и фотографируйте срезы под флуоресцентным микроскопом в 40, 20 и 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волны возбуждения DAPI UV составляет 330-380 нм, а длина волны излучения составляет 420 нм (синий свет). Длина волны возбуждения FITC составляет 465-495 нм, а длина волны излучения - 515-555 нм (зеленый свет).

7. Статистический анализ

  1. Собирайте и анализируйте данные с помощью SPSS.
  2. Сообщайте данные как среднее ± стандартное отклонение.
  3. Используйте независимый выборочный t-критерий для анализа различий между диабетической и нормальной группами.
  4. Установите статистическую значимость на уровне **p < 0,01 и *p < 0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В общей сложности 10 крыс SD получили одну внутрибрюшинную инъекцию STZ для индукции модели СД1. Одна крыса умерла преждевременно (10%), но диабет был индуцирован у всех крыс (100%). После 3 дней инъекции STZ уровень глюкозы в крови всех крыс был выше 16,7 ммоль / л, а уровень глюкозы в крови стабилизировался через 5 недель после индукции (рис. 3A). Вес группы диабетиков постепенно увеличивался после инъекции STZ, но уменьшался на 3-й неделе, а затем снова медленно увеличивался с 4-й недели (рис. 3B). Напротив, вес крыс в нормальной группе неуклонно увеличивался, и их средний вес через 3 дня после индукции диабета был выше, чем в группе диабетиков (рис. 3B). У всех крыс с диабетом наблюдались типичные симптомы жажды, полиурии и потери веса, аналогичные выводам Hao et al.17.

На 7-й и 14-й день после ранения макроскопический анализ показал, что реэпителизация была более выражена у крыс в нормальной группе, чем в группе диабетиков (рис. 4А). Количественные результаты показали, что скорость заживления ран была достоверно ниже в группе диабетиков, чем в группе с нормальным уровнем на 7-й и 14-й день (p < 0,01). Однако на 14-й день скорость заживления ран также может быть выше 90% в группе диабетиков (p < 0,05, рис. 4B). Это говорит о том, что модель раны СД1 характеризуется плохим закрытием, но не в такой степени, как хроническое незаживание, наблюдаемое при диабетических ранах человека.

Окрашивание H&E на 14-й день заживления раны выявило неполный эпидермис раны, медленную пролиферацию кератиноцитов и задержку реэпителизации в группе диабетиков по сравнению с нормальной группой. Диабетические раны показали частичную потерю волосяных фолликулов и сальных желез. Также было меньше видимых капилляров (рис. 5).

Диабет вызывает дисфункцию эндотелиальных клеток, гликозилирование белков внеклеточного матрикса и сосудистую денервацию18. Эти осложнения приводят к более низкому, чем обычно, ангиогенезу ран при диабетических ранах18. Ангиогенез необходим для заживления ран, а раневой ангиогенез часто анализируется с помощью иммуноокрашивания CD31 (рис. 6A)19,20. Исходя из средней оптической плотности (AOD) экспрессии CD31, ангиогенез в месте раны был достоверно выше в норме, чем в группе диабетиков (p < 0,01, рис. 6B).

figure-results-1
Рисунок 1: Изображение крыс, обездвиженных фиксаторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема расположения раны крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Уровни глюкозы в крови и вес экспериментальных крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Кожные раны на всю толщину (диаметром 20 мм) на спине экспериментальных крыс. (A) Макроскопический вид ран на 0-й, 7-й и 14-й день. Изображения морфологии ран на 0-й, 7-й и 14-й дни были получены с помощью цифровой камеры. (B) Площадь раны была измерена с помощью программного обеспечения ImageJ и использовалась для расчета скорости заживления раны. Скорость заживления раны (%) рассчитывали следующим образом: (начальная площадь раны − площадь раны в указанный момент времени)/начальная площадь раны × 100. Значения представлены как средние ± SD (n = 14). Статистическая значимость была установлена на уровне ** p < 0,01 и * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные гистопатологические изображения H&E на 14-й день после заживления раны. Синими стрелками обозначены капилляры. Красные стрелки показывают пролиферацию кератиноцитов. Левая шкала: один стержень = 200 мкм; Правая шкала: одна полоса = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания на экспрессию CD31. Уровни CD31 использовались для определения состояния ангиогенеза. (A) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания CD31 в диабетической и нормальной группах. Интегральное значение оптической плотности (IOD) и площадь пикселя (AREA) для каждого образца кожи были рассчитаны с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0. Также было получено среднее значение оптической плотности (AOD) (AOD = IOD/AREA). Значение AOD было прямо пропорционально положительной экспрессии CD31. (B) Количественное сравнение положительной экспрессии CD31 в диабетической и нормальной группах. Данные представлены в виде среднего ± SD. ** p < 0,01. Масштаб: один стержень = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол разъясняет спорные операции при моделировании раны СД1. В этой работе были рассмотрены вопросы, связанные с протоколами инъекций STZ, критериями успеха индукции СД1, временем стабилизации уровня глюкозы в крови, а также расположением и размером раны. Кроме того, уточнены патологические характеристики и измеримые параметры для оценки заживления ран СД1.

Крысы голодали в течение 18 ч перед инъекцией STZ, чтобы избежать конкурентного связывания глюкозы или ее аналогов с β-клетками, что могло повлиять на эффективность STZ. Наиболее часто используемым методом индукции СД1 является однократная высокая доза STZ, которая увеличивает уровень глюкозы в крови за счет повреждения островков и снижения секреции инсулина21. Предэкспериментальные испытания показали, что оптимальная доза STZ для высокой частоты успеха и низкого уровня смертности составила 55 мг / кг, что ниже оптимальных доз, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях22,23,24. В этом протоколе СД1 индуцировали с помощью однократной внутрибрюшинной инъекции 55 мг/кг STZ.

Уровень глюкозы в крови был выше 16,7 ммоль / л через 3 дня после инъекции STZ. Тем не менее, уровень глюкозы в крови выше 16,7 ммоль / л на 7-й день после инъекции STZ является рекомендуемым критерием для успешного моделирования СД1, поскольку степень повреждения островков варьируется у крыс, и соответствующее продление времени диагностики может снизить ложноотрицательную частоту. Кроме того, колебания уровня глюкозы в крови стабилизировались через 5 недель после инъекции STZ, и крысы постепенно набирали вес в течение этого периода, что согласуется с предыдущими результатами25,26. Это указывает на то, что уровень глюкозы в крови в модели СД1 должен быть стабилизирован в течение не менее 6 недель, а увеличение массы крысы через 6 недель снижает показатели смертности при моделировании раны. Следовательно, по этому протоколу проводилось моделирование раны через 8 недель после инъекции STZ.

Частота закрытия раны на 7-й и 14-й день после ранения была значительно ниже у диабетиков, чем в группе с нормальной раной, что указывает на медленное заживление. Более того, реэпителизация раны и ангиогенез были значительно ниже у диабетиков, чем в нормальной группе. Это свидетельствует о том, что модель раны СД1 демонстрирует более медленное заживление ран и замедленную реэпителизацию, чем у нормальных крыс, что может быть связано с патологическими изменениями сниженного раневого ангиогенеза. Однако на 14-й день скорость заживления ран СД1 также была выше 90%, что отличается от хронической незаживляющей характеристики диабетических ран человека. Это может быть связано с тем, что физиологические механизмы заживления ран у грызунов отличаются от таковых у людей27. Следовательно, наилучший диаметр раны составляет не менее 20 мм, что достаточно много, чтобы дать время оценить эффективность вмешательства в исследовании диабетической раны. Расположение раны должно избегать лопатки и позвоночника, так как непрерывное движение в этих двух местах может нарушить заживление раны.

В заключение следует отметить, что построение модели раны СД1 с использованием метода данного протокола является эффективным. Протокол воспроизводит некоторые характеристики хронических диабетических ран, такие как более медленное заживление ран, отсроченная реэпителизация и снижение ангиогенеза по сравнению с обычными ранами крыс. Однако неизвестно, может ли модель воспроизвести другие хронические фенотипы диабетических ран. Кроме того, этот протокол описывает наиболее фундаментальный и широко используемый метод, который не учитывает проблему сокращения кожи у крыс. Будущие исследования могут включать использование раневых шин в этот протокол или изучать дополнительные модели хронических диабетических ран, что станет серьезной проблемой для исследователей в будущем.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что данная рукопись не имеет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было финансово поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82104877).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Монтажная среда с защитой от выцветанияSouthern Biotechnology Associates, Inc.0100-01
Автофлуо ДавительСервисбио Технолоджи Ко., Лтд.G1221
Автоматический морилка для горкиThermo Fisher Scientific Inc.Varistain™ Gemini ES
CD31Servicebio Technology co., Ltd.GB11063-2
Раствор для извлечения цитратного антигенаServicebio Technology co., Ltd.G1201
Защитное стеклоCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd.10212432C
DAPIServicebio Technology co., Ltd.G1012
Шейкер для обесцвечиванияScilogexS1010E
Крем для депиляцииGuangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd.—
ДиметилбензолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.64-17-5
Лекарственный генераторШэньчжэнь Цзяши Технолоджи Ко., Лтд.VM-370
Электрическая бритваShanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd.FC5908
Встраиваемый станокWuhan Junjie Electronics Co., Ltd.JB-P5
Абсолютный этанолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.1330-20-7
Козий антикролик с маркировкой Fitc IgGServicebio Technology co., Ltd.
Сыворотка от козThermo Fisher Scientific Inc.
Раствор для окрашивания гематоксилина и эозинаBeijing Regan Biotechnology Co., Ltd.DH0020
Программное обеспечение Image JНациональных институтов здравоохранения—
Микроволновая печьMidea Group Co., Ltd. M1-L213B
Мини-центрифугаScilogexD1008
Нейтральный бальзамSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
PBS буферBiosharpG4202
Портативный глюкометрSinocare Inc.Тканевый процессор GA-3
Rapid от Thermo Fisher Scientific Inc.STP420 ES
Фиксатор крысGlobalebio (Пекин) Technology co., LtdGEGD-Q10G1
Машина для нарезкиThermo Fisher Scientific Inc.HM325
Стеклетное стеклоCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd.80312-3181
цитрат натрия буферBeijing Solarbio Science & Технология Ко., Лтд.c1013
СтрептозотоцинСигма57654595
GB2230316210064

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
  2. Grennan, D. Diabetic foot ulcers. Journal of the American Medical Association. 321 (1), 114(2019).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6(2014).
  4. Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615(2019).
  5. Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
  6. Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
  7. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78(2021).
  8. Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
  9. Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
  10. Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
  11. Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
  12. Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
  13. Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
  14. Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
  15. Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364(2016).
  16. Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
  17. Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
  18. Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267(2012).
  19. Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A. Diabetes and wound angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1419(2017).
  20. Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533(2020).
  21. Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
  22. Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
  23. Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
  24. Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10(2019).
  25. Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
  26. Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258(2022).
  27. Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type 1 DiabetesRat Wound ModelStreptozotocin InjectionDiabetic Wound HealingFull Thickness ExcisionBlood Glucose MeasurementRe EpithelializationWound AngiogenesisCD31 ImmunostainingChronic Wound Model

Related Articles