Количественная оценка репликационного стресса в клетках рака яичников с использованием одноцепочечной иммунофлуоресценции ДНК

Краткое содержание

Здесь мы описываем основанный на иммунофлуоресценции метод количественной оценки уровней одноцепочечной ДНК в клетках. Этот эффективный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения стресса репликации, который является общей чертой при некоторых видах рака яичников. Кроме того, этот анализ совместим с автоматизированным конвейером анализа, что еще больше повышает его эффективность.

Аннотация

Репликационный стресс является отличительной чертой нескольких видов рака яичников. Репликационный стресс может возникать из нескольких источников, включая двухцепочечные разрывы, конфликты транскрипции-репликации или амплифицированные онкогены, что неизбежно приводит к генерации одноцепочечной ДНК (ссДНК). Таким образом, количественная оценка ssDNA дает возможность оценить уровень репликационного стресса в различных типах клеток и при различных условиях или методах лечения, повреждающих ДНК. Новые данные также свидетельствуют о том, что ssDNA может быть предиктором ответов на химиотерапевтические препараты, которые нацелены на репарацию ДНК. Здесь мы подробно описываем основанную на иммунофлуоресценции методологию количественного определения ssDNA. Эта методология включает маркировку генома аналогом тимидина с последующим обнаружением аналога хроматина на основе антител в условиях без денатурации. Участки ssDNA можно визуализировать в виде очагов под флуоресцентным микроскопом. Количество и интенсивность очагов напрямую коррелируют с уровнем ссДНК, присутствующей в ядре. Мы также описываем автоматизированный конвейер для количественной оценки сигнала ssDNA. Метод быстрый и воспроизводимый. Кроме того, простота этой методологии делает ее пригодной для высокопроизводительных приложений, таких как скрининг лекарств и генетический скрининг.

Введение

Геномная ДНК часто подвергается множественным атакам из различных эндогенных и экзогенных источников¹. Частота эндогенных повреждений напрямую коррелирует с уровнями побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода или альдегиды, которые по своей природе выше при нескольких типах рака, включая рак яичников ^2,3. Крайне важно, чтобы повреждение ДНК было эффективно устранено; в противном случае он может способствовать генотоксическим поражениям и, следовательно, мутагенезу. Способность клеток восстанавливать генотоксические поражения зависит от функциональности безошибочн....

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия рака яичников OVCAR3 использовалась на этих этапах, но этот протокол широко применим к множеству других клеточных линий, в том числе полученных из источников, не связанных с яичниками. Схема протокола показана на рисунке 2.

1. Покрытие ячеек

1. Сделайте покровные стекла с покрытием из поли-L-лизина.
   1. Добавьте автоклавные покровные стекла диаметром 12 мм в коническую пробирку объемом 50 мл с раствором поли-L-лизина и поместите на коромысло на 15 минут.
   2. Аспирируйте раствор в тканевый культуральный колпак. Промойте покровные стекла, добавив стери....

Результаты

Репрезентативные изображения и количественная оценка очагов IdU из ядер, полученных из необработанных клеток и клеток, обработанных 0,5 мМ гидроксимочевиной в течение 24 часов, показаны на рисунке 4. Оба ядра окрашены и идентифицируются в канале DAPI. Анализ этих изображений заключается в количественной оценке количества очагов в каждом ядре. Количество очагов пропорционально степени репликационного стресса.

Обсуждение

Как было упомянуто в протоколе, полезно включить несколько экспериментальных контролей, чтобы убедиться, что анализ работает. К ним относятся образец, не обработанный IdU, а также образец, обработанный первичными антителами. Оба отрицательных элемента управления должны давать клетки, окрашенные DAPI, но не содержащие сигнала IdU.

Основываясь на экспериментальных условиях и используемых клеточных линиях, для получения наилучшего флуоресцентного сигнала могут потребоваться различные разведения а.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3% параформальдегид (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 г сахарозы + 100 мл 10X PBS + вода для доведения объема до 925 мл. Добавьте 75 мл PFA, не содержащего метанола 40%, перемешайте и сделайте аликвоты по 50 мл перед хранением Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
5-иодо-2'-дезоксиуридин (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 г/моль. Для 10 мМ запаса: растворить 3,541 мг IdU до 1 мл 1 Н жидкого аммиака<бр/> Хранение: хранить при -20 °°; C
Anti-BrdU антитело	BD Biosciences	347580	Хранение: Хранить в 4 ° C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 вторичное антитело	Thermo Scientific	A32766	Светочувствительное - хранить в темноте Хранение: Хранить в 4 ° C
Бычья сыворотка альбумина (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Получено путем добавления удельной массы к объему PBS Хранение: Хранить в 4 ° C
Круглое защитное стекло	Электронная микроскопия	72230-01
Программное обеспечение NIS GA3	Nikon
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Питательные среды: RPMI с добавлением L-глутамина, 0,01 мг/мл бычьего инсулина; фетальная бычья сыворотка до конечной концентрации 20% и 1X Pen Strep Хранение: Замораживание Среды: питательные среды + 5% ДМСО и хранение при -80 °°; C
Раствор поли-L-лизина	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Хранение: Хранить в 4 ° C
ProLong Diamond Antifade Mountant с DAPI	Thermo Scientific	P36962	Хранение: Хранить в 4 градусах;
C Трипсин-ЭДТА, 0,25%	Genesee Scientific	25-510	Хранение: Хранить при 4 ° C
Вода, стерильно отфильтрованная	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Хранение: Хранить в 4 ° С

77010604