Method Article

Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете представлена новая процедура подготовки образцов для визуализации нервно-мышечных соединений у личинок дрозофилы . Этот метод более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом и особенно полезен для ультраструктурного анализа нервно-мышечного соединения дрозофилы .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервно-мышечное соединение дрозофилы (NMJ) стало ценной модельной системой в области нейробиологии. Применение конфокальной микроскопии в Drosophila NMJ позволяет исследователям получать синаптическую информацию, охватывающую как количественные данные о распространенности синапсов, так и подробное понимание их морфологии. Тем не менее, диффузное распределение и ограниченный визуальный диапазон ПЭМ создают проблемы для ультраструктурного анализа. В этом исследовании представлен инновационный и эффективный метод пробоподготовки, который превосходит традиционный подход. Процедура начинается с помещения металлической сетки в основание бутылки или пробирки с плоским дном, после чего на сетку помещаются неподвижные образцы личинок. Дополнительная сетка помещается поверх образцов, гарантируя, что они расположены между двумя сетками. Неподвижные образцы тщательно обезвоживаются и инфильтрируются перед началом процедуры закладки. Затем встраивание образцов в эпоксидную смолу выполняется методом плоского листа, что позволяет подготовить мышцы к позиционированию и рассечению. Благодаря этим шагам все мышцы личинок дрозофилы могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, что облегчает последующее позиционирование и разделение. Избыток смолы удаляется после локализации6-й и7-й мышц сегментов тела А2 и А3. Проводится серийное ультратонкое сечение6-й или7-й мышцы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электронная микроскопия является одним из самых идеальных методов изучения ультраструктуры биологических материалов, способных наглядно и точно продемонстрировать внутреннюю структуру клеток нананомасштабе1. Однако из-за сложности процесса пробоподготовки и высокой стоимости электронная микроскопия не так популярна, как световая микроскопия. Последние достижения в области методов электронной микроскопии привели к значительному улучшению качества изображения, что совпало со значительным снижением связанной с этим рабочей нагрузки. Следовательно, электронная микроскопия взяла на себя важную роль в развитии научных знаний в различных областях

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод подготовки образцов с помощью просвечивающей электронной микроскопии, используемый в этой статье, был описан ранее16. Важно отметить, что подбор реагентов и корректировка дозировки необходимы в зависимости от образца. В процессе пробоподготовки используется множество токсичных химических реагентов, поэтому оператору необходимо принимать определенные меры защиты, такие как ношение защитной одежды и перчаток и работа в вытяжном шкафу.

1. Процедура диссекции, фиксации и установки

  1. Вскрытие
    1. Препарируйте блуждающих личинок позднего 3-го возраста в растворе Яна и получите ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стенка тела личинки дрозофилы состоит из 30 идентифицируемых мышечных волокон, расположенных в правильном порядке, и после вскрытия и фиксации выглядит как тонкий срез (рисунок 1А). В процессе обезвоживания образец остается плоским из-за наличия металлических сеток (рис. 1B, C). Мышца тела личинки погружена в тонкую пластину из эпоксидной смолы (рисунок 1D-G<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы личинок дрозофилы имеют тенденцию сворачиваться во время обезвоживания, так как образцы тонкие, что затрудняет точное определение местоположения нервно-мышечного соединения, тем самым увеличивая сложность и рабочую нагрузку на подготовку образцов. Традиционное усовершенствование заключается в укорачивании образца7, но образцы все равно были закручены в разной степени.

В нашем методе есть два важных этапа: во-первых, образцы остаются плоскими на протяжен.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая Grant 32070811 и Фондом аналитических испытаний Юго-Восточного университета (Китай) 11240090971. Мы благодарим Лабораторию электронной микроскопии и Центр морфологического анализа Школы медицины Юго-Восточного университета, Нанкин, Китай.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ЭпоксипропанSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Проникающий агент
Дрозофила АкцииБлумингтоннетВсе контрольные штаммы дрозофилы дикого типа, использованные в этом исследовании, были W1118 и были выращены в соответствии со стандартными методами культивирования
Стеклянные пробирки с плоским дномHaimen Chenxing Экспериментальное оборудование Компания нетСтеклянные пробирки с плоским дном (бутылка) с губчатой пробкой (или пробкой для бутылки)
K4M cross-linker  Agar ScientificCat# 1924BВстраиваемые смолы основаны на формуле с высокой степенью поперечной сшивки акрилата и метакрилата 
Смола K4M (мономер B)  Agar ScientificLot# 631557смола мономер
поливиниловая пленкаHaimen Chenxing Компания экспериментального оборудования нетПрозрачная полиэтиленовая пленка является лучшей, толщина около 0,2 мм
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFДодецениловый янтарный ангидрид
SPI-Chem DMP-30 Эпоксиднаясмола SPI02823-DAУскоритель
SPI-Chem NMASPI SpI#02828-AFОтвердитель для эпоксидной
смолы SPI-PON 812 ЭпоксиднаяSPISPI#0259-ABМономер
смолыСтальная сетка Садоводческий магазин Yuhuiyuan (онлайн)нетМедная или нержавеющая сталь
Просвечивающая электронная микроскопияHitachi H-765011416692Все сетки (на которых были собраны образцы) были окрашены цитратом свинца и наблюдались под действием просвечивающей электронной микроскопии.
Ультратонкий микротомLeica UC7 ультратонкий микротом595915Все операции секционирования выполняются на ультратонком микротоме Leica UC7 с помощью алмазного ножа
смола

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

Related Articles