Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64934

⸱

15 сентября 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В этом отчете представлена новая процедура подготовки образцов для визуализации нервно-мышечных соединений у личинок дрозофилы . Этот метод более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом и особенно полезен для ультраструктурного анализа нервно-мышечного соединения дрозофилы .

Аннотация

Нервно-мышечное соединение дрозофилы (NMJ) стало ценной модельной системой в области нейробиологии. Применение конфокальной микроскопии в Drosophila NMJ позволяет исследователям получать синаптическую информацию, охватывающую как количественные данные о распространенности синапсов, так и подробное понимание их морфологии. Тем не менее, диффузное распределение и ограниченный визуальный диапазон ПЭМ создают проблемы для ультраструктурного анализа. В этом исследовании представлен инновационный и эффективный метод пробоподготовки, который превосходит традиционный подход. Процедура начинается с помещения металлической сетки в основание бутылки или пробирки с плоским дном, после чего на сетку помещаются неподвижные образцы личинок. Дополнительная сетка помещается поверх образцов, гарантируя, что они расположены между двумя сетками. Неподвижные образцы тщательно обезвоживаются и инфильтрируются перед началом процедуры закладки. Затем встраивание образцов в эпоксидную смолу выполняется методом плоского листа, что позволяет подготовить мышцы к позиционированию и рассечению. Благодаря этим шагам все мышцы личинок дрозофилы могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, что облегчает последующее позиционирование и разделение. Избыток смолы удаляется после локализации6-й и7-й мышц сегментов тела А2 и А3. Проводится серийное ультратонкое сечение6-й или7-й мышцы.

Введение

Электронная микроскопия является одним из самых идеальных методов изучения ультраструктуры биологических материалов, способных наглядно и точно продемонстрировать внутреннюю структуру клеток нананомасштабе1. Однако из-за сложности процесса пробоподготовки и высокой стоимости электронная микроскопия не так популярна, как световая микроскопия. Последние достижения в области методов электронной микроскопии привели к значительному улучшению качества изображения, что совпало со значительным снижением связанной с этим рабочей нагрузки. Следовательно, электронная микроскопия взяла на себя важную роль в развитии научных знаний в различных областях2.

Дрозофила является отличной животной моделью для выполнения генетических манипуляций с целью точного контроля пространственной и временной экспрессии генов-мишеней. Кроме того, дрозофила имеет преимущества короткого периода роста и легкого выращивания по сравнению с моделями млекопитающих; поэтому дрозофила широко используется в морфологических исследованиях 4,5.

У личинок дрозофилы бутоны нервно-мышечного перехода (NMJ) широко распространены в мышцах 6,7, и иммуноокрашивание NMJ может легко предоставить информацию о количестве и морфологии синапсов 8,9 . Бутоны NMJ, расположенные в6-й/7-й мышцах сегментовА2 иА3, хорошо подходят для количественных и морфологических исследований с помощью световой микроскопии. Это связано с их размерами и обилием 10,11. Таким образом, NMJ для личинок дрозофилы считаются полезной моделью для исследований в области нейробиологии12.

Тем не менее, наблюдать ультраструктуру бутонов NMJ с помощью ПЭМ сложно. Поскольку окно сканирования просвечивающей электронной микроскопии узкое, трудно расположить широко распространенные NMJ boutons13. Другая причина заключается в том, что стенка тела дрозофилы подвержена скручиванию во время стадии обезвоживания алкоголя по протоколу подготовки образца7.

В традиционных исследованиях обычно выбирали бутоны между6-й и7-й мышцами сегментовА2 иА3 в качестве образцового материала из-за их обилия и размера14,15. 6-я и7-я мышцы сегментовА2 иА3 больше других мышц и содержат больше бутонов. Однако при подготовке образцов для электронной микроскопии неподвижные образцы имели тенденцию становиться тонкими и склонными к скручиванию, что приводило к неправильному расположению6-й и7-й мышц сегментовА2 иА3.

Настоящим мы сообщаем о новой процедуре обработки, которая является более эффективной в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом подготовки образцов 7,16, позволяя образцам оставаться плоскими во время последующего обезвоживания, тем самым способствуя лучшему позиционированию нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод подготовки образцов с помощью просвечивающей электронной микроскопии, используемый в этой статье, был описан ранее16. Важно отметить, что подбор реагентов и корректировка дозировки необходимы в зависимости от образца. В процессе пробоподготовки используется множество токсичных химических реагентов, поэтому оператору необходимо принимать определенные меры защиты, такие как ношение защитной одежды и перчаток и работа в вытяжном шкафу.

1. Процедура диссекции, фиксации и установки

  1. Вскрытие
    1. Препарируйте блуждающих личинок позднего 3-го возраста в растворе Яна и получите всю стенку тела на основе стандартных процедур17. Приготовьте раствор Яна следующим образом: 128 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 35 мМ сахарозы, 5 мМ HEPES, pH 7,4
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стенка тела личинок дрозофилы относится к наружной оболочке или покрову личиночной стадии плодовой мухи дрозофилы. Это включает в себя кутикулу, клетки эпидермиса и подлежащие ткани, которые формируют экзоскелет личинки. Стенка тела обеспечивает структурную поддержку и защиту и служит барьером между телом личинки и внешней средой17.
  2. Фиксация
    1. Зафиксируйте стенку тела личинки в камере вскрытия при температуре 4 °C на ночь с помощью фиксатора. Для приготовления фиксатора смешайте 2% глутаральдегида и 2% формальдегида в 0,1 М буфере из какодилата натрия (pH 7,4)
    2. Промойте образцы несколько раз буфером для какодилата натрия.
    3. Приготовьте 1% OsO4 в какодилатном буфере. Зафиксируйте образцы в 1% OsO4 в течение 2 ч, после чего последует несколько полосканий в дистиллированной воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двойная фиксация альдегидами и OsO4 обеспечивает лучшую защиту клеточной ультраструктуры. Кроме того, OsO4 может окрашивать ткань образца, что позволяет сделать контраст между светом и образцом более заметным18.
    4. Окрашивайте образцы нервно-мышечного соединения дрозофилы 2% насыщенным уранилацетатом в течение 2 ч, после чего следует несколько полосканий деионизированной водой (рис. 1A).
  3. Размещение образцов
    1. Вырежьте ножницами два круглых куска металлической сетки одинакового размера (размер пор 270 мкм).
    2. Заранее поместите металлическую сетку (270 мкм) в основание бутылки с плоским дном.
    3. Поместите неподвижные образцы личинок на сетку, а затем поместите на них еще одну сетку так, чтобы образцы оказались между двумя сетками.

2. Обезвоживание

ПРИМЕЧАНИЕ В данной работе был использован метод градиентной дегидратации этанола.

  1. Последовательно обезвоживайте образцы в возрастающем градиенте концентрации этанола (50%, 70%, 85%, 95% один раз, 100% дважды) в течение 20 мин при 4 °C.
  2. Дважды промойте образцы оксидом пропилена при комнатной температуре в течение 5 минут каждый раз (Рисунок 1C).

3. Проникновение

ПРИМЕЧАНИЕ: Инфильтрация является одним из необходимых этапов подготовки образцов ПЭМ. Инфильтрация позволяет осуществлять постепенную замену обезвоживающей среды на закладную среду в образце, что позволяет заполнить междоузлия ячейки закладной средой19.

  1. Поместите образцы в смешанный раствор оксида пропилена и эпоксидной смолы в соотношении 1:1 и 1:2 на 1 ч каждый, а затем в чистую эпоксидную смолу на 2 ч при комнатной температуре.

4. Встраивание

  1. Подготовьте полиэтиленовую пленку и разрежьте ее на большой квадрат (примерно 5 × 5 см) и небольшую полую прямоугольную опору (примерно 2 × 2 см). Соедините маленький квадрат с большим квадратом.
  2. Предварительно нанесите достаточное количество эпоксидной смолы в центр большого квадрата.
  3. Поместите образцы в предварительно нанесенную эпоксидную смолу мышечной стороной вверх. Используйте стереоскоп.
  4. Добавьте к образцам несколько капель смолы, а затем накройте их полиэтиленовой пленкой (чуть больше спейсера) (рисунок 1D-E).
  5. Полимеризуйте образцы при 37 °C, 42 °C и 60 °C в течение 24 часов соответственно (рис. 1F).

5. Порядок секционирования

  1. Острым лезвием удалите лишние части стенки тела личинки и оставьте трапецию, включая сегмент A2/A3 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя линия должна находиться рядом с13-й мышцей, а базовая линия должна быть удалена от образца к эпоксидной смоле. Высота между линией верха и базовой линией составляет примерно 5-8 мм.
  2. Удалите трапецию из остальной части образца и приклейте ее к наполненной смолой капсуле с помощью клея A/B.
  3. Подтвердите положение6-й и7-й мышц сегментовА2 иА3 под световой микроскопией (рис. 1G) и сохраняйте плоскость касательной, параллельную6-й мышце.
  4. Отрежьте одну пятую часть образца по двум сторонам сегментаА3 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите большую часть6-й мышцы и оставьте 1/3 ширины7-й мышцы.
  5. С помощью ультратонкого микротома подготовьте ультратонкий срез образца, начиная с6-й мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина каждого среза составляет примерно 90 нм.
  6. К каждой медной сетке прикрепляется как можно больше срезов.
  7. Проведите просвечивающую электронную микроскопию, как описано ранее16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стенка тела личинки дрозофилы состоит из 30 идентифицируемых мышечных волокон, расположенных в правильном порядке, и после вскрытия и фиксации выглядит как тонкий срез (рисунок 1А). В процессе обезвоживания образец остается плоским из-за наличия металлических сеток (рис. 1B, C). Мышца тела личинки погружена в тонкую пластину из эпоксидной смолы (рисунок 1D-G<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Образцы личинок дрозофилы имеют тенденцию сворачиваться во время обезвоживания, так как образцы тонкие, что затрудняет точное определение местоположения нервно-мышечного соединения, тем самым увеличивая сложность и рабочую нагрузку на подготовку образцов. Традиционное усовершенствование заключается в укорачивании образца7, но образцы все равно были закручены в разной степени.

В нашем методе есть два важных этапа: во-первых, образцы остаются плоскими на протяжен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая Grant 32070811 и Фондом аналитических испытаний Юго-Восточного университета (Китай) 11240090971. Мы благодарим Лабораторию электронной микроскопии и Центр морфологического анализа Школы медицины Юго-Восточного университета, Нанкин, Китай.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2-ЭпоксипропанSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Проникающий агент
Дрозофила АкцииБлумингтоннетВсе контрольные штаммы дрозофилы дикого типа, использованные в этом исследовании, были W1118 и были выращены в соответствии со стандартными методами культивирования
Стеклянные пробирки с плоским дномHaimen Chenxing Экспериментальное оборудование Компания нетСтеклянные пробирки с плоским дном (бутылка) с губчатой пробкой (или пробкой для бутылки)
K4M cross-linker  Agar ScientificCat# 1924BВстраиваемые смолы основаны на формуле с высокой степенью поперечной сшивки акрилата и метакрилата 
Смола K4M (мономер B)  Agar ScientificLot# 631557смола мономер
поливиниловая пленкаHaimen Chenxing Компания экспериментального оборудования нетПрозрачная полиэтиленовая пленка является лучшей, толщина около 0,2 мм
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFДодецениловый янтарный ангидрид
SPI-Chem DMP-30 Эпоксиднаясмола SPI02823-DAУскоритель
SPI-Chem NMASPI SpI#02828-AFОтвердитель для эпоксидной
смолы SPI-PON 812 ЭпоксиднаяSPISPI#0259-ABМономер
смолыСтальная сетка Садоводческий магазин Yuhuiyuan (онлайн)нетМедная или нержавеющая сталь
Просвечивающая электронная микроскопияHitachi H-765011416692Все сетки (на которых были собраны образцы) были окрашены цитратом свинца и наблюдались под действием просвечивающей электронной микроскопии.
Ультратонкий микротомLeica UC7 ультратонкий микротом595915Все операции секционирования выполняются на ультратонком микротоме Leica UC7 с помощью алмазного ножа
смола

Ссылки

  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  3. Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
  4. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  5. Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
  6. Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).
  7. Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
  8. Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).
  9. Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
  10. Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
  11. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  12. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
  13. Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
  14. Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
  15. McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
  16. Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
  17. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).
  18. Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
  19. Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
  20. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
  21. Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
  22. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
  23. Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
  24. Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
  25. Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
  26. Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Теги

Нейромышечный синапс Drosophilaизготовление ультратонких срезовзаливка в эпоксидную смолуконфокальная микроскопияпозиционирование мышцметод с использованием металлической сеткистенка тела личинкиструктура синапса
Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.