Развитие штаммов видов Leishmania с конститутивной экспрессией eGFP

Краткое содержание

В данной работе описывается методология получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген eGFP в виде стабильного интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Трансфицированных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции у обоих видов были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах на наркотики.

Аннотация

Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с разнообразными клиническими проявлениями, которое поражает миллионы людей во всем мире. Инфекция, вызванная L. donovani, может привести к смертельному заболеванию висцеральных органов. В Панаме, Колумбии и Коста-Рике L. panamensis является причиной большинства зарегистрированных случаев кожного и кожно-кожного лейшманиоза. Изучение большого количества препаратов-кандидатов с помощью доступных на сегодняшний день методик является достаточно сложным, учитывая, что они очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных форм паразита или для проведения анализов in vivo . В данной работе описывается генерация штаммов L. panamensis и L. donovani с конститутивной экспрессией гена, кодирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), интегрированный в локус, кодирующий 18S рРНК (ssu). Ген, кодирующий eGFP, был получен из коммерческого вектора и амплифицирован методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью его обогащения и добавления сайтов рестрикции для ферментов BglII и KpnI. Ампликон eGFP выделяли путем очистки агарозным гелем, расщепляли ферментами BglII и KpnI и лигировали в вектор экспрессии Leishmania pLEXSY-sat2.1, предварительно расщепленный тем же набором ферментов. Вектор экспрессии с клонированным геном размножали в кишечной палочке, очищали, а наличие вставки проверяли методом ПЦР колонии. Очищенную плазмиду линеаризировали и использовали для трансфекции паразитов L . donovani и L . panamensis. Интеграция гена была подтверждена методом ПЦР. Экспрессию гена eGFP оценивали методом проточной цитометрии. Флуоресцентных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с наибольшей интенсивностью флуоресценции отбирали с помощью проточной цитометрии.

Введение

Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с широким спектром клинических проявлений. Это заболевание распространено в 98 странах, а его ежегодная заболеваемость оценивается в 0,9–1,6 миллиона^{случаев1}. Виды Leishmania, патогенные для человека, подразделяются на два подрода, а именно L. (Leishmania) и L. (Вянния). Заражение некоторыми видами, относящимися к L. Подроды (Leishmania), такие как L. donovani и L. infantum, могут приводить к висцеральному лейшманиозу (ВЛ), который приводит к летальному исходу, если его не лечить². Виды, принадлежащие к семейству L. Подрод (Viannia) ассоциирован с большинством случаев кожного лейшманиоза (КЛ) и слизисто-кожного лейшманиоза (МКЛ) в Центральной и Южной Америке, особенно в Панаме, Колумбии и Коста-Рике, причем L. panamensis является основным этиологическим агентом этих клинических проявлений ^3,4.

Существующая химиотерапия против лейшмании, которая включает такие препараты, как пятивалентные сурьмяны, милтефосин и амфотерицин В, является высокотоксичной и дорогостоящей. Кроме того, к факторам, препятствующим эффективному лечению^{пациентов во всем} мире, добавилась возросшая в последние десятилетия лекарственная устойчивость 5. Существенные различия были продемонстрированы между видами рода Leishmania в отношении восприимчивости к лекарственным препаратам, особенно между видами Нового и Старого Света ^6,7. По этим причинам необходимо направлять усилия на выявление и разработку новых препаратов против лейшмании, уделяя особое внимание видоспецифичным подходам. Изучение больших библиотек лекарственных препаратов-кандидатов с помощью традиционных методологий является достаточно сложным, учитывая, что эти методики очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных амастигот или для проведения экспериментов in vivo ⁸; В связи с этим возникла необходимость в разработке новых методов, позволяющих уменьшить эти недостатки, включая внедрение репортерных генов и разработку высокосодержательных фенотипических скрининговых тестов⁹.

Использование репортерных генов показало потенциал для повышения эффективности процесса скрининга лекарственных средств, поскольку это облегчает разработку высокопроизводительных анализов и анализов in vivo. Рекомбинантные паразиты Leishmania, экспрессирующие несколько репортерных генов, были созданы различными исследовательскими группами. Репортерные гены, такие как β-галактозидаза, β-лактамаза и люцифераза, были введены у нескольких видов Leishmania с использованием эписомальных векторов, что показало ограниченную полезность для скрининга лекарств во вне- и внутриклеточных формах паразита 10,11,12,13,14,15. Эти подходы имеют ограничение, заключающееся в том, что они требуют сильного селективного давления в культуре, чтобы избежать элиминации эписомальной конструкции, а также использования дополнительных реагентов для выявления активности репортерного гена. И наоборот, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариант, усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), были использованы при генерации большого количества трансгенных штаммов лейшмании для скрининговых анализов на лекарственные препараты in vitro благодаря их гибкости и чувствительности, а также возможности автоматизации процесса скрининга с помощью проточной цитометрии или флуорометрии^{15. 16,17,18,19}. Несмотря на многообещающие результаты, культуры этих трансгенных штаммов были крайне неоднородны по уровню флуоресценции, поскольку количество копий гена GFP не было одинаковым у всех паразитов. Кроме того, поддержание флуоресценции требовало постоянного селективного давления на паразитов в культуре, поскольку ген GFP был введен в эписомальную конструкцию.

По причинам, изложенным выше, многие усилия были сосредоточены на разработке новых методологий получения стабильных рекомбинантных штаммов. Эти усилия в основном основывались на интеграции репортерных генов в рибосомные локусы, используя преимущества более высокой скорости транскрипции рибосомных генов²⁰. Штаммы L. infantum и L. amazonensis были получены с интеграцией генов, кодирующих β-галактоцидазу 21, IFP 1.4, iRFP²² и tdTomato²³, и они были оценены на предмет их полезности в скрининговых тестах на наркотики. В различных группах были выведены штаммы L. donovani, которые конститутивно экспрессируют GFP путем интеграции его кодирующего гена в локус 18S рибосомной РНК (локус ssu) посредством гомологичной рекомбинации^24,25; они показали стабильную и гомогенную экспрессию GFP в трансфицированной популяции, включая внутриклеточные амастиготы 24,25, и были успешно реализованы в скрининговых анализах на лекарственные препараты^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 разработали штаммы L. major и L. infantum, экспрессирующие GFP в виде интегрированного трансгена. Они использовали интеграционный вектор pLEXSY, первоначально разработанный для трансгенной экспрессии белков в системе, использующей L. tarentolae в качестве хозяина²⁸. Вектор pLEXSY-GFP показал себя очень эффективным для генерации различных штаммов Leishmania, конститутивно экспрессирующих GFP 24,25,27,29,30. У этих паразитов флуоресценция однородна и поддерживается во внутриклеточных формах, что может быть обнаружено в поражениях подушечек лап инфицированных мышей²⁷.

В данной работе описана методика получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген, кодирующий eGFP, в виде интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Штаммы, полученные в результате этого процесса, используются в нашей лаборатории для проведения скрининговых анализов на наркотики, которые оценивают потенциальную антилейшманийную активность молекул природного и синтетического происхождения.

Протокол

Для поддержания стерильности образцов все этапы, связанные с культивированием паразитов, должны выполняться в колпаке уровня биобезопасности 2 (BSL-2) или в соответствии с местными правилами охраны труда и техники безопасности. Графическое описание этого протокола можно найти на рисунке 1.

Рисунок 1: Сводная схема протокола генерации eGFP-экспрессирующих паразитов L. panamensis и L. donovani с использованием семейства векторов pLEXSY-2.1. Здесь изображены все шесть основных разделов, описанных в статье. 1) Амплификация и вставка гена eGFP в вектор pLEXSY-2.1: ген-мишень амплифицируют, добавляя сайты узнавания ферментов KpnI и BglII, и ампликон eGFP и плазмиду pLEXSY последовательно расщепляют обоими ферментами для последующего лигирования Т4-лигазой. 2) Линеаризация плазмиды экспрессии pLEXSY: конструкция pLEXSY + eGFP расщепляется с помощью SwaI для линеаризации и очистки кассеты экспрессии 7-8 kbp. 3) Трансфекция и 4) поликлональная селекция: промастиготы Leishmania трансфицируют экспрессионной кассетой методом электропорации и помещают обратно в культуру для антибиотикоотбора рекомбинантных паразитов. Флуоресценция паразита подтверждается с помощью проточной цитометрии. 5) Подтверждение геномной интеграции и 6) клонирование путем предельного разведения: интеграция экспрессионной кассеты pLEXSY-eGFP подтверждается диагностической ПЦР с использованием прямой гибридизации праймера с экспрессионной кассетой и обратной гибридизации праймера с хромосомной последовательностью, отсутствующей в экспрессионной кассете. Трансфицированные культуры могут быть обогащены для флуоресцентных паразитов путем клонирования путем ограничения разведения, а клоны с самой высокой средней интенсивностью флуоресценции могут быть отобраны для дальнейшего применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

1. Амплификация и вставка гена eGFP в вектор pLEXSY-2.1

1. Амплификация гена eGFP
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе используется семейство векторов pLEXSY-2.1 (см. таблицу материалов) для конститутивной экспрессии белков-мишеней после интеграции экспрессионной кассеты в хромосомный локус 18S рРНК (ssu) видов Leishmania , первым шагом является введение в ген eGFP последовательностей, содержащих сайты рестрикции, которые позволяют его встраивать в векторы pLEXSY-2.1. В этом случае, поскольку eGFP требуется только цитозольная экспрессия, сайты рестрикции для ферментов BglII и KpnI были добавлены в 5' и 3' конце гена eGFP соответственно. Клонирование с помощью KpnI приводит к слиянию белка-мишени с С-концевой полигистидиновой меткой из шести остатков, за которой следует стоп-кодон, кодируемый в плазмиде pLEXSY-2.1 для дальнейшей очистки интересующего белка. По этой причине последовательность обратного праймера не содержит стоп-кодона.
   1. В зависимости от источника плазмиды для eGFP проанализируйте целевую последовательность с помощью инструмента рестрикционного анализа, такого как NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ , чтобы убедиться, что она не содержит внутренних сайтов для ферментов рестрикции, используемых для клонирования (BglII и KpnI), или для SwaI, фермента, используемого для векторной линеаризации перед трансфекцией.
   2. Разработка прямых и обратных праймеров для амплификации eGFP, содержащих рестрикционные последовательности BglII и KpnI. В качестве примера, источником eGFP для этого протокола была плазмида pEGFP-N1-1X³², а последовательностями праймеров были те, о которых сообщили Bolhassani et ^al.27:
      Передний праймер (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (сайт ограничения BglII выделен жирным шрифтом).
      Обратный праймер (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI сайт ограничения выделен жирным шрифтом).
   3. Амплифицировать ген-мишень с помощью полимеразы высокой точности, чтобы обеспечить сохранность кодирующей последовательности. Например, для праймеров EGFP1 и EGFP2 используйте протокол циклического ПЦР, как сообщают Bolhassani et ^al.27. Выполните начальную денатурацию в течение 2 минут при 94 °C, затем 30 циклов по 30 с при 94 °C, 30 с при 57 °C и 1 мин при 72 °C. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Добавьте праймеры в конечной концентрации 0,2 мкМ.
   4. Очищают фрагмент с помощью обычного набора для очистки продукта ПЦР или стандартного осаждения ацетата натрия и этанола, как описано в другом месте³³.
2. Вставка eGFP в вектор экспрессии pLEXSY-2.1
   1. Обрежьте концы продукта eGFP-PCR с помощью BglII и KpnI, следуя инструкциям производителя.
      1. Сначала устанавливают реакцию для фермента, требующего наименьшей концентрации соли (в данном случае KpnI), в соответствии с инструкциями производителя, и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
      2. Затем добавляют 100 мМ NaCl и 10 единиц BglII и инкубируют в течение 15 минут. Очистите реакцию, как описано в шаге 1.1.4.
   2. Переварите вектор экспрессии pLEXSY с помощью BglII и KpnI, следуя протоколу последовательного разложения, описанному в шаге 1.2.1.
   3. Лигируйте вектор pLEXSY и ген eGFP Т4-лигазой, используя молярное соотношение 1:3 (вектор:вставка). Кратковременно добавляют 100 нг переваренного pLEXSY и 28 нг переваренного продукта eGFP в реакцию, содержащую 20 мкл лигазный буфер при конечной концентрации 1x и 3 единиц ДНК-лигазы T4. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
   4. Трансформируют компетентные клетки E. coli , такие как XL-10, DH5α или DH10B, продуктом лигирования, полученным на этапе 1.2.3, с использованием стандартных протоколов трансформации³³. Трансформированные клетки помещают в ампициллиновый агар Луира-Бертани (LB) и инкубируют в течение 24 ч при 30 °C для отбора рекомбинантных клонов (плазмиды pLEXSY более стабильны в E. coli при 30 °C, чем при 37 °C).
   5. Скрининг на наличие вставки в плазмидах методом колонной ПЦР.
      1. Отбирают отдельные колонии, ресуспендируют в 20 мкл воды, не содержащей нуклеаз, нагревают при 95 °C в течение 15 мин и берут 1 мкл лизата в качестве матрицы ДНК для ПЦР колоний. Используйте прямой праймер для амплификации eGFP, описанный в шаге 1.1.2 (в данном примере EGFP1), и праймер A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACTACTACTAAAAAG-3') в качестве обратного праймера²⁹.
      2. Праймер А264 предназначен для отжига 80.н. после стоп-кодона вставки в векторах экспрессии pLEXSY-2.1. В качестве примера для пары праймеров EGFP1 + A264 используют протокол циклирования ПЦР, состоящий из начальной денатурации 2 мин при 94 °С, за которыми следуют 30 циклов по 30 с при 94 °С, 30 с при 50 °С и 1 мин при 72 °С. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Праймеры добавляются в конечной концентрации 0,2 мкМ.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый продукт, использующий этот набор праймеров, имеет длину 859.н. Участки отжига грунтовок EGFP1 и A264 изображены на рисунке 2.
   6. Подготавливают очищенную плазмидную ДНК из положительного клона для последующей трансфекции с помощью коммерческого набора для выделения плазмид или стандартного щелочного осаждения³³. Используйте 50 мл ночной культуры при 30 °C для выделения не менее 10 мкг плазмидного/положительного клона.

2. Линеаризация плазмиды экспрессии pLEXSY

1. Используйте не менее 10 мкг очищенной плазмиды pLEXSY-eGFP для расщепления с SwaI (сайт узнавания: 5'-ATTTAAAT-3'). Выдерживают в течение 3-4 ч при 25 °C и нагревают при 65 °C в течение 20 мин.
2. Пропустите продукт сбраживания в электрофорезе агарозного геля, чтобы отделить полученные фрагменты. В результате этого разложения образуются два фрагмента: фрагмент массой 2,9 к..н., представляющий элементы, необходимые для репликации и отбора в E. coli, и фрагмент массой 7-8 тыс..н., представляющий линеаризованную экспрессионную кассету.
3. Очистите кассету для сцеживания с помощью коммерческого набора для экстракции агарозным гелем.

3. Трансфекция L. panamensis и L. donovani методом электропорации

ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование лейшмании проводится, как описано в другом месте³⁴. В этом примере промастиготы L. panamensis и L . donovani культивировали в среде насекомых Шнайдера, добавляли 20% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 26 °C.

1. Выращивайте культуры паразитов до тех пор, пока не накопится достаточное количество промастигот в логарифмической или ранней стационарной фазе, чтобы использовать примерно 4 x 10⁷ паразитов за одну трансфекцию. Максимальная плотность клеток на культуральную колбу до достижения стационарной фазы может варьироваться в зависимости от вида Leishmania и того, насколько хорошо штаммы адаптированы к лабораторным условиям. При необходимости объедините содержимое нескольких колб с культурой.
2. Центрифугируют культуру паразитов при 2 000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
3. Ресуспендируйте гранулу в электропорационном буфере при 4 °C (21 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМ_Na2HPO₄ и 6 мМ глюкозы; pH 7,5)²⁷ до получения концентрации 1 x 10⁸ паразитов/мл. Поставить на лед на 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием электропорационный буфер должен быть стерилизован путем фильтрации.
4. Параллельно с этим пробирки предварительного охлаждения с 2-10 мкг линеаризованного pLEXSY-eGFP конструируются в максимальном объеме 50 мкл воды или 10 мМ трис-буфера (pH 8,0) и электропорационных кюветах d = 2 мм.
5. Добавьте в пробирку с линеаризованной плазмидой 350 мкл предварительно охлажденных паразитов и перенесите все 400 мкл в электропорационную кювету на льду. Параллельно электропорируют клетки паразита без плазмидной ДНК в качестве отрицательного контроля.
6. Электропорация по одному из этих двух протоколов:
   Экспоненциальный спад: 450 В, 450 мкФ, один импульс.
   Постоянная времени: 450 В, T = 3,5 мс, один импульс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти протоколы были запущены с использованием коммерческого генератора генов (таблица материалов) с модулями PC и CE.
7. Поставьте кювету обратно на лед на 10 мин и перенесите электропорированных паразитов в 5 мл соответствующей питательной среды. В этом примере использовалась среда Шнайдера для насекомых, дополненная 20% (v/v) FBS. Инкубируют при 26 °C в течение 20 ч.

4. Поликлональный отбор в культуре

1. Примерно через 20 ч после электропорации наблюдают за культурами под микроскопом. Не менее половины популяции паразитов должны демонстрировать визуально хорошую морфологию и подвижность (каплевидные промастиготы с осциллирующим жгутиком, движущимся по среде и/или образующим активные агрегаты паразита). Добавьте соответствующий селективный антибиотик в зависимости от используемой плазмиды pLEXSY. В данном примере используется pLEXSY-sat2.1, который содержит стрептотрицинацетилтрансферазу в качестве селекционного маркера. Поэтому используют нурсеотрицин в качестве селективного антибиотика в концентрации 0,1 мг/мл.
2. Наблюдайте за посевами под микроскопом до тех пор, пока не будет видна четкая разница между паразитами, электропорированными с плазмидной ДНК и без нее.
3. Проверьте флуоресценцию паразита с помощью проточной цитометрии.
   1. Центрифугу 1 мл культуры в неподвижной фазе при 2 000 x g в течение 3 мин при RT. Дважды промывают в PBS и повторно суспендируют конечную гранулу в 1 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция eGFP может быть обнаружена в канале FL1 большинства коммерческих цитометров. Настройки усиления для прямого и бокового рассеяния, а также канала FL1 могут различаться в зависимости от цитометра. Для этого примера был использован цитометр CyFlow space (Sysmex).
   2. Запустите выборки, собрав 20 000 событий со скоростью 0,5 мкл/с, и установите значения усиления для каналов прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) и флуоресценции 1 (FL-1) равными 225,0, 200,0 и 520,0 соответственно. Запустите контрольную выборку с нефлуоресцентными паразитами, чтобы определить популяцию паразитов на точечной диаграмме FSC и SSC.
   3. Создайте вентиль (G1), содержащий популяцию паразитов, и отфильтруйте канал FL-1 через этот вентиль для определения автофлуоресценции промастигот и установки вентили диапазона (G2) для канала FL-1.
   4. Запустите трансфицированных паразитов, чтобы проверить, есть ли флуоресценция. Запишите процент флуоресцентных паразитов в G1 и среднюю интенсивность флуоресценции в G2.

5. Подтверждение геномной интеграции

ПРИМЕЧАНИЕ: Интеграция экспрессионной кассеты pLEXSY-eGFP может быть подтверждена с помощью диагностической ПЦР с использованием прямой гибридизации праймера с экспрессионной кассетой (варьируется в зависимости от используемого вектора pLEXSY-2.1) и обратной гибридизации праймера F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACTACAGCTAC-3') с хромосомной ssu-фланговой последовательностью, отсутствующей в экспрессионной кассете. В этом примере прямой праймер F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') используется при гибридизации в экспрессионной кассете pLEXSY-sat2.1. Схематическое изображение интегрированной экспресс-кассеты и участков отжига праймера для диагностической ПЦР изображено на рисунке 2.

1. Очистите геномную ДНК от 2-5 мл культуры паразитов в стационарной фазе с помощью обычной экстракции фенол/хлороформ³⁵ или с помощью коммерческого набора.
2. Выполните диагностическую ПЦР для pLEXSY-sat2.1 с использованием протокола циклирования, состоящего из начальной денатурации 2 мин при 94 °C, за которыми следуют 30 циклов по 30 с при 94 °C, 30 с при 53 °C и 1 мин при 72 °C. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Праймеры добавляются в конечной концентрации 0,2 мкМ.

Рисунок 2: Схематическое изображение интегрированной кассеты экспрессии. Прямоугольники, помеченные как Chr-S (серого цвета), представляют собой соседние хромосомные последовательности локуса 18S рРНК (ssu), в который интегрирована экспрессионная кассета. Интегрированная экспрессионная кассета состоит из 5'- и 3'-последовательностей (синий) для гомологичной рекомбинации в локус ssu , дополнительного рибосомного промотора Leishmania (красный) для усиленной продукции белка, гена eGFP (зеленый), гена-маркера отбора (желтый) и трех нетранслируемых областей (светло-серый), а именно utr1, 2 и 3, которые обеспечивают сигналы сплайсинга для посттранскрипционной обработки мРНК для оптимизации экспрессии eGFP и маркера отбора у паразитов Leishmania . Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для проверки наличия вставки методом колонной ПЦР (шаг 1.2.5), отмечены черными стрелками, обозначенными как cpcr-fwd (праймер EGFP1) и cpcr-rev (праймер A264) соответственно, которые разграничивают продукт с молекулярной массой 859.н. Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для верификации геномной интеграции с помощью диагностической ПЦР (шаг 5), отмечены черными стрелками, помеченными как sat-fwd (праймер F2999) и ssu-rev (праймер F3002) соответственно, которые разграничивают продукт 2,271.о. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

6. Клонирование путем предельного разбавления (опционально)

1. После подтверждения флуоресценции методом проточной цитометрии готовят разведение рекомбинантных паразитов в концентрации пять промастигот/мл³⁶.
2. Добавьте 100 мкл этого разведения в каждую лунку 96-луночного планшета. Таким образом, планшеты засеваются со средней плотностью 0,5 промастиготы/лунку, что гарантирует, что в некоторые лунки попадет один паразит, сводя к минимуму вероятность наличия более одного паразита на лунку³⁶.
3. Оставьте тарелку нетронутой минимум на 12 часов. Следите за планшетом под микроскопом при минимальном увеличении 100x до тех пор, пока не будут обнаружены лунки с ростом паразитов.
4. Когда лунка планшета заполнена паразитами, используйте содержимое для посева культуры объемом 5 мл. Это занимает 1-2 недели.
5. Когда клонированные культуры достигнут стационарной фазы, проверьте флуоресценцию с помощью проточной цитометрии, как описано в шаге 4.3. Выберите клоны, которые будут использоваться для дальнейших анализов in vitro и in vivo на основе процентного содержания флуоресцентных паразитов и средней интенсивности флуоресценции, измеренной в канале FL-1. Стремитесь к клонам с 98%-99% флуоресцентных паразитов и выбирайте те, у которых самая высокая средняя интенсивность флуоресценции.

Результаты

После построения конструкции pLEXSY-eGFP и трансформации компетентных клеток E. coli колонии, содержащие конструкцию со вставкой eGFP, будут генерировать продукт примерно 859.н. после проведения ПЦР колоний, описанной в разделе 1.2 (рис. 3A). При полном расщеплении очищенной плазмиды из позитивных колоний с помощью SwaI при гель-электрофорезе должны быть получены два характерных фрагмента: фрагмент массой 2,9 к..н., представляющий собой часть вектора PLEXSY, содержащий все ...

Обсуждение

Преимущества и недостатки различных репортерных генов были изучены у нескольких простейших паразитов. Среди них GFP и eGFP по своей природе флуоресцентны и позволяют легко проводить количественную оценку и визуализацию. Флуоресцентная активность этих белков может быть обнаружена с минимальными манипуляциями с помощью флуоресцентной микроскопии, флуориметрии или проточной цитометрии. Было проведено мало исследований по генерации GFP-экспрессирующей L. (Viannia), несмотря на продемонстрированную устойчиво...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96 лунок Микропланшеты	Corning	CLS3340	Плоское дно прозрачное, черный полистирол, стерильный, крышка
Агароза	Sigma-Aldrich	A4718
Ампициллин натриевая соль	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, подходит для клеточных культур
BglII фермент рестрикции	New England BioLabs	R0144S	2,000 ед. 10,000 ед./мл
Колбы для клеточных культур	Corning	CLS430168	Площадь поверхности 25 см2, скошенная горловина, колпачок (заглушка)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Нет в наличии
D-(+)-глюкоза	Sigma-Aldrich	G7021	порошок, биореагент, подходит для клеточной культуры, подходит для клеточной культуры насекомых, подходит для культуры растительных клеток, > 99,5%
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F7524
Гелевый буфер для загрузки	Sigma-Aldrich	G2526	Скорость миграции варьируется в зависимости от состава геля. Разбавьте образец в соотношении от 1:3 до 1:6 перед загрузкой.
Система электропорации Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	Система состоит из основного блока, двух вспомогательных модулей, расширителя емкости (модуль CE) и контроллера импульсов (модуль PC), а также кюветной камеры ShockPod.
Gene Pulser/MicroPulser Кюветы для электропорации	Bio-Rad	1652086	шт 50, 0,2 см&nдаш; стерильная электропорационная кювета, для использования с системами Gene Pulser и MicroPulser, для клеток млекопитающих и других эукариот
раствор гентамицина	Sigma-Aldrich	G1397	50 мг/мл в деионизированной воде, жидкость, 0,1 мкм; m фильтрованный, БиоРеагент, подходит для клеточной культуры
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES раствор	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, стерильно-отфильтрованный, БиоРеагент, подходит для клеточной культуры
Инвертированный микроскоп	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF рестрикционный фермент	New England BioLabs	R3142S	4,000 ед. 20,000 ед/мл
LB Бульон с агаром	Sigma-Aldrich	L3147	Высокореферентная питательная среда для микробного роста с агаром, подходящая для регулярных  E.coli  культура.
LB Бульон	Sigma-Aldrich	L2542	Жидкая микробная питательная среда
Mini-Sub Cell GT Система горизонтального электрофореза	Bio-Rad	1640300	Мини система горизонтального электрофореза, включает в себя 8- и 15-луночные гребни, 7 см x 10 см УФ-прозрачный лоток
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	экспрессии eGFP мРНК, слитая с 1 тандемным повтором 50-базовой последовательности
pLEXSYcon2.1 набор для экспрессии Jena	Бионаука	EGE-1310sat	Содержит интегративный конститутивный вектор экспрессии pLEXSY-sat2.1. Подбор антибиотиков трансфектантов с Нурсеотрицином (NTC, clonNAT). Содержит все праймеры для диагностической ПЦР и секвенирования.
Миллипор	хлорида калия	529552	класс молекулярной биологии - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	до 15 μ г готовой к трансфекции плазмиды из культур объемом 3 мл.
Schneider′ s Среда для насекомых	Sigma-Aldrich	S0146	Среда, используемая в нашей лаборатории для культивирования Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium хлорид	Sigma-Aldrich	S3014	для молекулярной биологии, ДНКазы, РНКазы и протеазы, не обнаружен, ≥ 99% (титрование)
Двухосновной фосфат натрия	Sigma-Aldrich	RDD038	Биореагент, подходит для клеточной культуры, подходит для клеточной культуры насекомых, ≥ 99,0%, сыпучий,
рестрикционный фермент	New England BioLabs	R0604S	2 000 шт. 10 000 шт/мл
Шприцевые фильтры	Corning	CLS431212	регенерированной целлюлозной мембраной, диаметр 4  мм, размер пор 0,2  μ m
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Система термоамплификатора, включает в себя 96-луночный термоамплификатор, шнур питания, опорное кольцо для трубки
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Соединяет две нити ДНК со связными или тупыми концами
Трис-Борат-ЭДТА буфер	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, подходит для электрофореза, 10&кратный концентрат
Wizard Genomic DNA Набор для очистки	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0,1 мл. Содержит ген устойчивости к канамицину на F'-эписоме для чрезвычайно требовательного клонирования в векторах, устойчивых к хлорамфениколу. КПД: > 5 x 10 9 трансформаторов/&микро; g pUC18 ДНК.