$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ожирение, характеризующееся увеличением массы жировой ткани (АТ) и провоспалительным ремоделированием иммунных клеток АТ, стало серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире, поскольку оно резко увеличивает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета 2 типа и заболеваний печени. Следовательно, изучение структуры и функции АТ стало важной клинической задачей. В этой коллекции методов мы представляем несколько современных методов, разработанных для исследования структуры и функции АТ при физиологических и патологических состояниях.
АТ представляет собой гетерогенную ткань, состоящую из нескольких клеточных популяций, включая зрелые адипоциты, жировые клетки-предшественники (APC), фиброзно-воспалительные предшественники (FIP), эндотелиальные клетки и иммунные клетки. Поэтому для того, чтобы охарактеризовать эту ткань, может быть выполнено фенотипирование отдельных клеток. В своих статьях Cho et al. и Peics et al. предлагают протоколы для выделения и характеристики белых AT-резидентных APC мышей методом сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)1,2. Этот шаг имеет решающее значение не только для подсчета количества резидентных АПК, что является важным фактором для определения способности к экспансии АТ, но и для дальнейшего изучения функции этих клеток на уровне отдельных клеток. Peics et al. также предлагают метод выделения мышиных белых AT-резидентных FIPs2, неадипогенных клеток, продуцирующих коллаген, которые могут способствовать развитию провоспалительного фенотипа, который, как известно, играет роль в дисфункции AT. Аналогичным образом, Estrada-Gutierrez et al. описывают протокол одновременной изоляции жизнеспособных зрелых адипоцитов и клеток стромальной васкулярной фракции из висцеральных биопсий АТ человека3. В целом, эти протоколы являются золотым стандартом для создания суспензии одной клетки из АТ человека и мыши, что является первым важным шагом для дальнейшего подсчета и функционального фенотипирования различных субпопуляций АТ-клеток.
Взаимосвязь между структурой и функцией очень актуальна в АТ. Отличительным признаком дисфункции АТ при ожирении является увеличение размера адипоцитов и глубокое ремоделирование АТ. Это ремоделирование влияет не только на популяции адипоцитов и иммунных клеток, но и на лимфатическую сеть и сеть кровеносных сосудов. Чтобы оценить эти изменения во всей АТ, Гиллерон и др. разработали очень простой, недорогой ибыстрый протокол очистки АТ. Этот простой протокол трехмерно визуализирует морфологию биопсии АТ всей мыши и большой биопсии АТ человека. Это включает в себя нейронные и сосудистые сети, адипоциты, а также распределение врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые являются важными параметрами для изучения ожирения и связанных с ним патологий. Чтобы охарактеризовать влияние ожирения на лимфатические и кровеносные сосуды АТ, Czepielewski et al. предлагают метод in vivo для одновременного окрашивания лимфатической арборизации и кровеносных сосудов путем инъекции фторхром-конъюгированных лектинов5. Этот протокол позволяет анализировать in vivo морфологию обеих сетей, включая их плотность, объем и ветвление. Интересно, что сочетание этой стратегии маркировки с процедурой очистки АТпозволяет с высоким разрешением отображать всю АТ мыши в трехмерном (3D) масштабе с высоким разрешением. В целом, эти подходы могут охарактеризовать структуру АТ в физиологических и патофизиологических условиях, получая представление о корреляции между структурой и функцией АТ.
Из-за высокой гетерогенности и огромной способности к ремоделированию, анализ функции адипоцитов в AT in vivo не является простой задачей, поэтому было разработано несколько систем культивирования. Основным преимуществом всех этих систем клеточных культур является высокий уровень контроля над популяцией клеток и микроокружением. Jager et al. разрабатывают простой протокол для манипулирования экспрессией РНК в дифференцированных зрелых адипоцитах 3T3-L16. Несмотря на то, что эта система культивирования далека от идеальных физиологических условий, адипоциты 3T3-L1 остаются функциональными в отношении передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза. Таким образом, этот протокол предоставляет мощный инструмент для манипулирования экспрессией белков и некодирующих РНК и изучения их роли в функциях адипоцитов. Чтобы приблизиться к идеальным физиологическим условиям, Poret et al. описывают метод получения функциональных зрелых адипоцитов с использованием стволовых клеток, полученных из макаки-резуса AT7. Этот протокол объясняет, как изолировать первичные ADSC и как индуцировать их пролиферацию и дифференцировку. Авторы также предполагают, что эта процедура может быть адаптирована к другим видам. Хотя эта система культивирования ближе к идеальным физиологическим условиям по сравнению с клеточной линией 3T3-L1, зрелые адипоциты, полученные из первичных ADSC, выращиваются в 2D, что отличается от in vivo. Чтобы справиться с этой проблемой, Batista Jr. et al. разработали эффективный протокол для трехмерной печатной системы культивирования тканей8. В этой работе авторы генерируют адипосфероиды из клеток стромальной фракции стромальных сосудов мышей и дифференцируют предшественники адипоцитов непосредственно в этой 3D-системе культивирования. Этот подход бесповоротно ближе к идеальным физиологическим условиям, чем метод 2D-культивирования, но следует учитывать отсутствие сосудов, которые могли бы доставлять питательные вещества к адипоцитам в центре сфероидов. Модулирующая экспрессия белка и некодирующей РНК, как описано6, в этих культуральных системах может привести к дальнейшему пониманию функциональной роли этих мишеней в более физиологически значимых адипоцитах. Однако такую сложную систему еще предстоит создать. Основной интерес этих систем для культивирования ex vivo/in vitro заключается в высоком уровне контроля над микроокружением, которое также включает в себя факторы, секретируемые клетками. В этом отношении протокол Akbar et al. изолирует и характеризует внеклеточные везикулы (ВВ), секретируемые адипоцитами человека9. Недавно было обнаружено, что ВВ являются важными регуляторами метаболизма; этот метод является обязательным для анализа метаболического воздействия этих ВВ, полученных из адипоцитов, в различных метаболических ситуациях.
В настоящей коллекции методов мы даем обзор современных протоколов, охватывающих несколько аспектов анализа АТ, включая системы культивирования ex vivo и in vitro , 3D-исследование целых тканей и анализ отдельных клеток. Несмотря на то, что ни одна система культивирования не является идеальной, важно выбрать ту систему культивирования, которая адаптирована к биологическому вопросу. Таким образом, эта коллекция методов предоставляет большой набор процедур для выделения, дифференцировки и манипулирования адипоцитами in vitro. Объединение всех описанных здесь методов приведет к пониманию морфологии и функции АТ.