Неприменимо
Методическая статья
14 июля 2023 г.
Неприменимо
Покрывая ~40% человеческого тела, скелетные мышцы являются основным органом, поддерживающим важнейшие функции от движения до дыхания и обмена веществ. Важно отметить, что он обладает уникальной способностью к самовосстановлению после травмы и благодаря этой регенеративной способности обеспечивает полное функциональное и структурное восстановление после серьезных повреждений менее чем за месяц. Несколько типов клеток были вовлечены в эту замечательную способность к восстановлению, при этом центральную роль играют мышечные стволовые клетки.
Исследователи мышц по всему миру разработали несколько анализов для анализа скелетных мышц на функциональном, молекулярном и клеточном уровнях. Каждый метод имеет свои сильные стороны, а тестирование in vivo на животных моделях представляет собой вариант, наиболее актуальный для человека и сложности живых организмов. Аналоги in vitro и ex vivo завоевывают популярность, поскольку исследовательские группы по всему миру стремятся свести к минимуму исследования на животных с учетом международно признанного принципа «Замещение-Сокращение-Уточнение» (3R). Эта коллекция методов была направлена на предоставление моделей in vivo и ex vivo для молекулярных, клеточных и функциональных мышечных исследований у разных видов.
Montandon et al.1 описывают методы быстрой характеристики фенотипов регенерации мышц у рыбок данио рерио контрольного и мутантного генотипов. Во-первых, эмбрионы генотипируются с использованием материала, который стряхивают с животных, находящихся под наркозом. Это захватывающая перспектива, поскольку большинство протоколов, включающих генотипирование генетически модифицированных эмбрионов, требуют одновременного жертвоприношения эмбриона. Затем регенерация индуцируется путем прокалывания определенной области мускулатуры личинки данио-рерио. Благодаря оптическим свойствам саркомера целостность поврежденной мышцы можно оценить с помощью визуализации после травмы. Этот протокол представляет большой интерес для ученых, изучающих регенерацию мышц, поскольку это быстрый, потенциально высокопроизводительный метод исследования различных мутантов на предмет регенеративных дефектов.
Hüttner et al.2 и Pegoli et al.3 представили метод, который позволяет проводить клеточные и молекулярные исследования мышечных стволовых клеток, клеточной популяции, лежащей в основе мышечной регенерации. Этот метод очень интересен для исследователей, занимающихся исследованиями ранней активации и взаимодействий между клеточными нишами. Метод одиночных культур миоволокон позволяет культивировать и изучать мышечные стволовые клетки до 96 ч, пока они еще связаны с мышечными волокнами, получая сигналы от этой ближайшей, эндогенной, ниши. Этот метод особенно сложен для разработки из-за множества тонких этапов, которые Хюттнер и др.2 тщательно объясняют (например, мягкое рассечение мышц и диссоциация). Идя еще дальше, авторы подробно описывают нацеливание миРНК для функционального анализа факторов, которые могут влиять на поведение стволовых клеток, и подчеркивают важность сравнения миРНК-трансфицированных и контрольных трансфицированных клеток от одной и той же мыши и мышцы. Параллельно с этим Pegoli et al.3 описывают, как этот метод может быть скорректирован для изучения мышечных стволовых клеток в контексте мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса и ранней постнатальной жизни, уделяя особое внимание проблемам, связанным с хрупкостью мышц в этом контексте. Чтобы повысить эффективность протокола, они направляют читателей изображениями волокон с хорошей и плохой выживаемостью, а также подчеркивают необходимость «эмпирической проверки» времени пищеварения.
Zaidan et al.4 описывают систему культивирования скелетных мышц ex vivo , которая способствует производству резервных клеток в состоянии покоя, а также поддерживает ряд других типов клеток, что представляет проблемы при использовании альтернативных систем культивирования. Таким образом, этот метод может быть полезен для исследователей, ориентированных на исследования покоя или взаимодействия нишевых стволовых клеток, в том числе в условиях, которые модифицируют молекулярные пути с помощью лекарств, миРНК или векторов. Протокол предполагает быстрое рассечение мышц задних конечностей с последующим ферментативным перевариванием и фильтрацией. После этого клетки помещают в культуру, с появлением резервных клеток в течение одной недели. Протокол позволяет проводить крупномасштабную амплификацию этих резервных клеток с возможностью визуализации живых клеток с использованием генетически помеченных мышей, таких как Pax7nGFP.
Park et al.5 демонстрируют, как нитраты и нитриты могут быть измерены в скелетных мышцах, одном из основных органов хранения нитратов. Описанный метод представляет особый интерес для исследователей, изучающих физиологию физических упражнений и нервно-мышечные или метаболические нарушения, связанные с циклом оксида азота. Несмотря на то, что существует значительное технологическое развитие, облегчающее измерение нитратов и нитритов, существует несколько параметров, которые могут повлиять на конечный результат и тщательно описаны и сравнены авторами (например, метод гомогенизации, размер биопсии, тип мышц).
Hessel et al.6 очень подробно описывают процедуру взятия биопсии из передней большеберцовой мышцы пациентов с целью получения волокон достаточной длины для проведения механических экспериментов. Авторы подчеркивают, что следует исключить пациентов с недавним повреждением мышцы. После того, как получено информированное согласие пациентов, соответствующих критериям, ультразвуковое исследование используется для оценки наилучшего участка в мышце для сбора биопсии. После обсуждения идеального пути инъекции команда проводит биопсию с помощью специализированной иглы. Наконец, подробно описываются методы послеоперационного ухода за пациентом и обработки тканей. Этот метод представляет особый интерес для врачей-ученых, которые хотят стандартизировать забор тканей у пациентов для механических исследований мышечных волокон.
В этой коллекции методов механические исследования представлены Brightwell et al.7 и Corona et al.8. В этих статьях обсуждаются методы измерения силы на моделях мелких и крупных животных. Нервно-мышечное заболевание или травма негативно влияют на мышечную силу; Таким образом, физические упражнения, питание и терапевтические вмешательства направлены на его восстановление. Brightwell et al.7 подробно описывают метод оценки функции четырехглавой мышцы у мышей по аналогии с методами, используемыми у людей. Во-первых, они предусматривают шаги по подготовке оборудования и программного обеспечения, необходимых для эксперимента. Затем мышь обезболивается и устанавливается в положение для оценки функции разгибателя. Электроды размещаются в дистальной части квадрицепса для индукции сокращения, оценивается оптимальный ток, а также записываются и анализируются измерения пикового изометрического тетанического крутящего момента. Используя более крупную животную модель, Corona et al.8 оценивают изометрический крутящий момент в тыльной мышце задней конечности свиньи, показывая пошаговые настройки оборудования и протокол измерения силы. Следует отметить, что они показывают высококачественные и низкокачественные волновые фронты, чтобы обеспечить оптимальное получение результата. Они признают сильные стороны этого неинвазивного метода, который позволяет проводить продольные анализы одного и того же животного, но также подробно обсуждают критические шаги (например, стимуляцию нервов, механическое выравнивание) и ограничения метода.
В области исследования скелетных мышц остается еще много нерешенных вопросов: какие гены имеют решающее значение для регенерации мышц, как клетки-сателлиты поддерживают регенеративный потенциал на протяжении жизни такого большого количества различных организмов и как это влияет на мышечную функцию при различных заболеваниях. В этой коллекции представлен ряд современных методов исследования мышечной функции и восстановления на молекулярном и механическом уровнях с использованием широкого спектра модельных систем. Предоставив подробные протоколы, авторы этих статей уже помогли повысить согласованность и прозрачность фундаментальных и прикладных исследований скелетных мышц.
Авторам нечего раскрывать.
Никакое внешнее финансирование не поддержало эту работу.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение