$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все многоклеточные организмы на Земле, включая животных и растения, произошли от одноклеточных эукариот ~1,7 миллиардалет назад. В отличие от примитивных прокариот, эукариотические клетки имеют мембранное ядро и множество мембранных органелл в своей цитоплазме, включая митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ЭР), лизосомы и везикулы. Эти органеллы образуют компартменты, в которых локализованы специализированные биологические функции и высокоэффективная метаболическая активность. Из-за ограниченного разрешения световой микроскопии большинство внутриклеточных органелл содержат функциональные структуры, которые попадают под предел световой дифракции, что затрудняет их визуализацию2. Инновационные методы микроскопического и биологического мечения начинают позволять визуализировать с высоким разрешением ультратонкие архитектуры и динамику органелл in vivo . Эта коллекция объединяет новейшие методы, которые успешно маркировали и визуализировали различные внутриклеточные органеллы у разных видов и, таким образом, углубили наше понимание пространственно-временной регуляции биологии органелл.
В последние десятилетия развитие флуоресцентных сенсоров и мечение белков в живых клетках значительно облегчили наше понимание динамики внутриклеточных сетей, передачи сигналов и межклеточных взаимодействий. Используя передовые методы неорганического синтеза, флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы с наноразмерными размерами, также известные как квантовые точки или квантовые точки, были изобретены в качестве нового класса оптических репортеров. В норме частицы QD имеют размер в пределах 2–10 нм и обладают высокой фоточувствительностью, стабильностью и низкой цитотоксичностью для клеток. Частицы квантовых точек появились в качестве альтернативы органическим красителям и флуоресцентным белкам для визуализации внутриклеточных процессов с высоким разрешением. В протоколе Aishwarya et al. авторы описывают QD-опосредованное иммуномечение с последующей визуализацией с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM)3. Выполнив мечение QD, нацеленную на антитела, и визуализацию в рамках ПЭМ со сверхвысоким разрешением, авторы успешно визуализировали локализацию Sigmar1 на нескольких клеточных органеллах в клетках сердца взрослых мышей и подчеркнули его обогащение на лизосомах и митохондриальных мембранах. Помимо подчеркивания высокого разрешения и высокой чувствительности QD-TEM, авторы также упоминают несколько недостатков методов. Например, тетраоксид осмия, используемый в QD-опосредованном иммуномечении, необратимо разрушает свойства образца, а оптимизация этапов фиксации и демаскирования антигена является ключевым, но сложным элементом для обеспечения высокого качества изображений.
Помимо квантовой точки, многие другие красители были успешно применены для мечения органелл в живых клетках. Эти методы облегчили визуализацию процесса трансформации или транслокации клеточных органелл in vivo в реальном времени. Иногда для одновременной визуализации различных типов органелл используется несколько красителей, специфичных для органелл. В протоколе Liu, Li et al.4 авторы предоставляют подробный протокол для окрашивания в реальном времени и визуализации как митохондрий, так и лизосом в клетках эмбриональных фибробластов мышей (MEF) с использованием двух различных красителей: MitoTracker Green и LysoTracker Red4. В этом исследовании оба красителя показали высокую флуоресцентную чувствительность и стабильность, специфичные для митохондрий и лизосом соответственно. Кроме того, авторы успешно наблюдали и регистрировали критический in vivo клеточный процесс митофагии, индуцированный карбонилцианидом-4 (трифторметокси) фенилгидразоном (FCCP) в клетках MEF с использованием протокола. В ходе обсуждения авторы упоминают, что протокол может быть применен к различным клеточным линиям или клеткам из тканей за счет оптимизации концентрации красителя и времени окрашивания.
Используя репортерные конструкции, состоящие из органелл-специфичных белков, слитых с флуоресцентными метками, можно наблюдать in vivo динамику органелл и паттерны экспрессии без иммуномечения. В протоколе Liu, Zhu et al.5 авторы предоставляют подробный протокол визуализации большинства типов субклеточных органелл у живых почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae5. Для новичков, работающих с почковающимися дрожжами, этот протокол полезен для изучения того, как определять субклеточную локализацию белка и отслеживать интересующие органеллы с помощью покадровой визуализации. Ограничением протокола является то, что большинство конструкций, используемых в протоколе, не могут быть использованы для мечения органелл у других видов. Для различных типов эукариотических клеток органеллоспецифичные паттерны флуоресцентных белков все еще нуждаются в валидации с помощью иммуноокрашивания антителами.
Впервые был разработан анализ поглощения антител для специфического живого мечения эндосомальной передачи сигналов Notch/Delta в предшественниках сенсорных органов Drosophila notum6. Из-за чувствительной к дозе природы передачи сигналов Notch/Delta, экспрессия репортерной конструкции внутри клеток не подходит для визуализации передачи сигналов Notch/Delta in vivo, поскольку дополнительная копия гена, слившегося с репортером, нарушила бы нормальную передачу сигналов и, в свою очередь, судьбу клетки. В протоколе Чжао и Го7 авторы применяют анализ поглощения антител для визуализации эндосомального трафика Notch/Delta в предшественниках радиальной глии развивающегося мозга данио-рерио7. Согласно протоколу, после микроинъекции конъюгированного антитела против DeltaD-Atto647N точно в эмбриональный желудочек заднего мозга через 24 hpf (часа после оплодотворения), весь процесс эндосомального транспорта регистрируется с использованием интернализованного антитела против DeltaD-Atto647N на протяжении всего митоза предшественников радиальной глии. В ходе исследования было обнаружено, что анализ поглощения антител не влияет на передачу сигналов Notch/Delta. Этот протокол может быть использован для визуализации передачи сигналов других мембранных лиганд-рецепторов при наличии антитела к внеклеточному домену интересующего белка.
Последние разработки в области экспансионной микроскопии (ExM), включающей физическое расширение образца внутри набухающего гидрогеля, позволили использовать обычные конфокальные микроскопы для визуализации со сверхвысоким разрешением. С момента своего изобретения ExM был протестирован на многих различных типах биологических образцов8. Одной из основных проблем ExM является потеря флуоресцентного сигнала на этапах полимеризации и разложения. Недавно разработанная система ExM для удержания этикеток решила проблему с трехфункциональными анкерами9. В протоколе Park et al.10 авторы описывают, как выполнить ExM с удержанием метки (LR-ExM) с помощью набора трехфункциональных якорей10. Протокол улучшает визуализацию в расширяющей микроскопии не только за счет предотвращения потери сигнала, но и за счет повышения эффективности маркировки метками SNAP или CLIP. В своем исследовании авторы успешно продемонстрировали многоцветный LR-ExM для различных субклеточных структур и достигли одномолекулярного разрешения при сочетании LR-ExM со стохастической оптической реконструктивной микроскопией сверхвысокого разрешения (STORM).
С быстрым развитием микроскопии сверхвысокого разрешения и появлением новых методов флуоресцентного мечения мы можем ожидать дальнейшего совершенствования методов и протоколов визуализации внутриклеточных органелл с беспрецедентным разрешением. Эти усилия призваны привести к новым прорывам в понимании динамики и функций внутриклеточных органелл.