Методическая статья

Измерение митохондриального биоэнергетического профиля нейтрофилов в режиме реального времени

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64971

⸱

2 июня 2023 г.

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Описаны ступенчатые протоколы измерения митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека и клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

Аннотация

Нейтрофилы являются первой линией защиты и наиболее распространенными лейкоцитами у человека. Эти эффекторные клетки выполняют такие функции, как фагоцитоз и окислительный взрыв, и создают нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО) для микробного клиренса. Новое понимание метаболической активности нейтрофилов бросает вызов ранней концепции о том, что они в первую очередь полагаются на гликолиз. Точное измерение метаболической активности может выявить различные метаболические потребности нейтрофилов, включая цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) (также известный как цикл Кребса), окислительное фосфорилирование (OXPHOS), пентозофосфатный путь (PPP) и окисление жирных кислот (FAO) в физиологических условиях и в болезненных состояниях. В этой статье описывается пошаговый протокол и предварительные требования для измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания на нейтрофилах, полученных из костного мозга мыши, нейтрофилах, полученных из крови человека, и нейтрофильной клеточной линии HL60 с использованием анализа метаболического потока на анализаторе метаболического внеклеточного потока. Этот метод может быть использован для количественной оценки митохондриальных функций нейтрофилов в норме и при заболеваниях.

Введение

Митохондрии играют важную роль в биоэнергетике клеток, которая генерирует аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В дополнение к этому, роль митохондрий распространяется на генерацию и детоксикацию активных форм кислорода, цитоплазматическую и митохондриальную матриксную регуляцию кальция, клеточный синтез, катаболизм и транспорт метаболитов внутри клетки1. Митохондриальное дыхание необходимо для всех клеток, так как их дисфункция может привести к метаболическим проблемам 2, включая сердечно-сосудистые заболевания3 и широкий спектр нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация4, болезни Паркинсона и Альцгеймера5 и болезнь Шарко-Мари-Тута2 A (CMT2A)6.

Электронно-микроскопические исследования нейтрофилов показали, что митохондрий7 относительно немного, и они в значительной степени зависят от гликолиза для производства энергии, поскольку скорость митохондриального дыхания очень низкая8. Однако митохондрии имеют решающее значение для функций нейтрофилов, таких как хемотаксис9 и апоптоз10,11,12. Предыдущее исследование выявило сложную митохондриальную сеть в нейтрофилах человека с высоким мембранным потенциалом. Потеря потенциала митохондриальной мембраны является ранним индикатором апоптоза нейтрофилов10. Лечение митохондриальным разъединителем карбонильного цианида м-хлорфенилгидразоном (CCCP) показало значительное ингибирование хемотаксиса, а также изменение морфологии митохондрий 9,10.

Хотя основным источником энергии для нейтрофилов является гликолиз, митохондрии обеспечивают АТФ, которая инициирует активацию нейтрофилов, подпитывая первую фазу пуринергической передачи сигналов, которая усиливает передачу сигналов Ca2+, усиливает продукцию митохондриальной АТФ и инициирует функциональные реакции нейтрофилов13. Дисфункция митохондриальной дыхательной цепи приводит к избыточной продукции токсичных активных форм кислорода (АФК) и приводит к патогенным повреждениям14,15,16. Нетоз, который представляет собой процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НЭО), является важнейшим свойством нейтрофилов, которое помогает им бороться с патогенами17 и способствует развитию многих патологических состояний, включая рак, тромбоз и аутоиммунные расстройства18. АФК митохондриального происхождения способствуют NETosis19, митохондриальная ДНК может быть компонентом NETs18, а измененный митохондриальный гомеостаз ухудшает NETosis 20,21,22,23,24. Кроме того, во время нормальной дифференцировки или созревания метаболическое перепрограммирование нейтрофилов обращается вспять, ограничивая гликолитическую активность, и они участвуют в митохондриальном дыхании и мобилизуют внутриклеточные липиды25,26.

Анализатор метаболического внеклеточного потока может непрерывно контролировать и количественно определять митохондриальное дыхание и гликолиз живых клеток. В анализаторе используется 96-луночный картридж пластинчатого формата и два флуорофора для количественного определения концентрации кислорода (O2) и изменений pH. Сенсорный картридж находится над монослоем ячейки во время анализа и образует микрокамеру высотой ~200 нм. Пучки оптических волокон в анализаторе используются для возбуждения флуорофоров и обнаружения изменений интенсивности флуоресценции. Изменения концентрации O2 и рН в режиме реального времени автоматически рассчитываются и отображаются как скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного подкисления (ECAR). На картридже датчика имеется четыре порта, которые позволяют загружать до четырех соединений в каждую скважину во время измерений. Этот протокол фокусируется на количественной оценке митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека, а также нейтрофилоподобных клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) UConn Health, а разрешение на использование грызунов было получено от UConn Health IACUC в соответствии с критериями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения. В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL / 6 в возрасте 6 недель.

1. Подготовка 96-луночного планшета для анализа метаболического внеклеточного потока

  1. Сенсорный картридж упакован поверх специально разработанной 96-луночной пластины для анализа метаболического внеклеточного потока. Гидратируйте картридж, осторожно подняв его, и поместите 200 мкл на лунку калибровочной среды в каждую лунку нижележащей пластины. Поместите картридж на пластину с калибром в увлажненный инкубатор без CO2 с температурой 37 °C на ночь для увлажнения.
  2. В зависимости от типа клеток используйте специальное покрытие для культуральной пластины, чтобы обеспечить клеточную адгезию. Для человеческих нейтрофилов - недифференцированных и дифференцированных клеток HL60 - покройте 96-луночную пластину стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), содержащим 50 мкл очищенного мышиного антитела CD18 против человека (клон TS1/18) при 4 ° C в течение ночи. Для мышиных нейтрофилов покройте 96-луночную пластину 25 мкл 22,4 мкг/мл Cell Tak при pH 8,0 в 0,1 М NaHCO3 при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин.
  3. Вымойте пластины 200 мкл стерильного PBS дважды.
  4. Добавьте полную среду в угловые лунки (A1, A12, H1 и H12) пластины для культивирования клеток (без клеток) для коррекции фона в планшетах для клеточных культур во время посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение во время нанесения покрытия и калибровки может повлиять на объем калибровочной среды и нормализацию. Используйте лоток или камеру со стерильной тканью, смоченной водой, и поместите пластину с калибрантом над ней, чтобы предотвратить испарение.

2. Подготовка и посев клеток

  1. Приготовление пробирной среды
    1. Приготовьте тестовую среду, добавив 1 мМ пирувата, 10 мМ глюкозы и 2 мМ глютамина в модифицированную среду Eagle (DMEM) Дульбекко.
  2. Выделение нейтрофилов мыши из костного мозга
    1. Изолируйте нейтрофилы мыши из костного мозга с помощью набора для обогащения нейтрофилов мыши в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Обезболивают мышей внутрибрюшинной (внутривенной) инъекцией кетамина (125 мг/кг) и ксилазина (12,5 мг/кг), а затем усыпляют мышей при вывихе шейки матки.
    3. Заготавливают бедренные и большеберцовые кости, как описано ранее27. Вкратце разрежьте кожу, чтобы обнажить ногу с мышцами. Разрежьте тазобедренный сустав, чтобы убрать ногу из туловища. Затем удалите мышцы, чтобы собрать бедренную и большеберцовую кости.
    4. Обрежьте меньшие концы бедренной и большеберцовой костей. Удерживая срезанные концы вниз, поместите их в центрифужную пробирку объемом 0,5 мл с двумя отверстиями для шприца 25 г в нижней части и поместите пробирку объемом 0,5 мл в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл (рис. 1A). Добавьте 50 мкл PBS в пробирку объемом 0,5 мл, чтобы предотвратить высыхание клеток костного мозга.
    5. Центрифугу при 5 900 × г при ЛТ в течение 15 с для сбора костного мозга на дне пробирки объемом 1,5 мл. Ресуспендировать клетки костного мозга с помощью 1 мл DMEM. Добавьте 50 мкл крысиной сыворотки из набора, аккуратно перемешайте пипеткой и перенесите клеточную суспензию в пробирку для культуры полистирола объемом 5 мл.
    6. Добавьте 50 мкл обогащающего коктейля из набора для обогащения нейтрофилов мыши и инкубируйте в течение 15 мин при ЛТ. Центрифуга при 300 × г при ЛТ в течение 5 мин.
    7. Ресуспендировать клетки 1 мл DMEM, добавить 50 мкл коктейля для отбора биотина из набора, аккуратно перемешать пипеткой и инкубировать в течение 15 минут при ЛТ.
    8. Добавьте 150 мкл вихревых магнитных частиц из набора, аккуратно перемешайте пипеткой и инкубируйте в течение 10 мин при RT.
    9. Добавьте ~ 1,3 мл DMEM, аккуратно перемешайте пипеткой, поместите пробирку в магнит на 3 минуты и перенесите надосадочную жидкость, содержащую очищенные нейтрофилы мыши, в новую пробирку для культуры полистирола объемом 5 мл, инвертировав исходную пробирку вместе с магнитом.
    10. Центрифуга при 300 × г при ЛТ в течение 5 мин. После удаления надосадочной жидкости с помощью вакуум-аспирации ресуспендируют клетки 1 мл анализирующей среды.
    11. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра.
    12. Отрегулируйте плотность клеток до 1,1 × 106 клеток/мл, добавив анализную среду, затравку 180 мкл суспензии нейтрофилов мыши (2 × 105 клеток) на лунку в подготовленную 96-луночную пластину (этапы 1,2-1,4), и центрифугируйте планшет при 300 × г при RT в течение 3 мин без тормоза, чтобы обеспечить надлежащее прилегание клеток к нижней части планшета.
    13. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе без CO2 с температурой 37 °C в течение 1 часа, чтобы предварительно уравновесить клетки анализирующей средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота нейтрофилов имеет решающее значение для анализа, поскольку это потенциальное смещение. Чистота выделения нейтрофилов мыши составляет 69,9%-88,7% по этому протоколу. Существуют и другие методы выделения нейтрофилов из костного мозга мыши, такие как центрифугирование в градиентеплотности 28. Существуют также альтернативные наборы для выделения нейтрофилов от других поставщиков, основанные на отрицательном магнитном отборе с использованием моноклональных антител против антигенов, которые не экспрессируются на нейтрофилах.
  3. Выделение нейтрофилов человека из периферической крови
    1. Добавьте 8 мл раствора полисахарида в центрифужную пробирку объемом 15 мл, затем наложите поверх раствора полисахарида 4 мл периферической крови без перемешивания.
    2. Центрифуга при 550 × г при 20 °C в течение 30 мин. Заставьте ротор замедлиться на 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время отделения нейтрофилов может варьироваться у разных доноров. Это минимум 30 минут, и дополнительные 10-20 минут могут потребоваться, если отделение нейтрофилов не увенчалось успехом.
    3. Наблюдайте за разделением плазмы/тромбоцитов и мононуклеарных клеток после центрифугирования, как показано на рисунке 1B. Осторожно удалите верхнюю желтую жидкость сверху (плазму и тромбоциты) и верхнюю мутную полосу (мононуклеары), не нарушая нижнюю мутную полосу (нейтрофилы), используя пипетку объемом 1 мл.
    4. Соберите нижнюю мутную полосу и ~ 3-4 мл прозрачной жидкости внизу в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл PBS.
    5. Центрифугу при 400 × г при 20 °С в течение 10 мин и удаление надосадочной жидкости методом вакуум-аспирации.
    6. Ресуспендируют клетки 5 мл PBS и центрифугу при 300 × г при 20 °C в течение 5 мин.
    7. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируют клетки 1 мл анализирующей среды.
    8. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эритроциты в крови не имеют митохондрий, загрязнение эритроцитов не влияет на митохондриальный стресс-тест и предотвращает активацию/прайминг нейтрофилов29,30. Эритроциты необходимо лизировать во время подсчета клеток, чтобы получить точную концентрацию нейтрофилов. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 891 мкл деионизированной воды в течение 10-30 с для лизиса эритроцитов, затем добавьте 99 мкл 10x PBS, чтобы сбалансировать осмотическое давление, избегая лизиса нейтрофилов.
    9. Отрегулируйте плотность клеток до 2,2 × 106 клеток/мл, добавив анализовую среду, засеяв 180 мкл нейтрофилов человека (~ 4 × 105) на лунку в подготовленную 96-луночную пластину и центрифугируйте планшет при 300 × г при RT в течение 3 мин без тормоза, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток на дне планшета.
    10. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе без CO2 при температуре 37 °C в течение 1 часа, чтобы предварительно уравновесить клетки анализирующей средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота нейтрофилов имеет решающее значение для анализа, поскольку это потенциальная погрешность. Чистота выделения нейтрофилов человека составляет 86,6%-96,8%. Существуют и другие методы центрифугирования в градиенте плотности для выделения нейтрофилов из крови человека, включая выделение по Перколлу, а также комбинацию выделения по Фиколлу и седиментациидекстрана 31.
  4. Культура клеток HL60 и нейтрофил-направленная дифференцировка
    1. Поддерживайте клетки HL60 в среде Мемориального института Розуэлл-Парк (RPMI)-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицина B при 37 ° C и 5% CO2.
    2. Для дифференцировки, направленной на нейтрофилы, поддерживайте клетки HL60 (взвешенные клетки) в колбе T25 при плотности 1 × 10 5 клеток/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 250 нг/мл амфотерицина B и 1,3% диметилсульфоксида (ДМСО) при 37 ° C и5 % CO2 в течение 6 дней.
    3. В день анализа подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра, центрифуги дифференцированных или недифференцированных клеток HL60 при 300 × г при RT в течение 5 мин, промыть DMEM один раз и ресуспендировать клетки с анализирующей средой, чтобы получить плотность клеток 1,39 ×10 6 клеток / мл.
    4. Засейте 180 мкл дифференцированных или недифференцированных клеток HL60 (~ 2,5 × 105) на лунку в подготовленную 96-луночную пластину и центрифугируйте пластину при 300 × г при RT в течение 3 мин без тормоза, чтобы обеспечить надлежащее прилипание клеток к дну планшета.
    5. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе без CO2 с температурой 37 °C в течение 1 часа, чтобы предварительно уравновесить клетки анализирующей средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите полную адгезию клеток с помощью микроскопа перед следующим шагом.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Принципиальная схема выделения клеток костного мозга и нейтрофилов. (А) Сбор клеток костного мозга у мыши и (Б) выделение нейтрофилов из крови человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тип ячейкиКоличество клеток в лункеСоединения/РеагентыКонцентрация рабочего раствораОбъем впрыска в портыКонечная концентрация в скважинах
Нейтрофилы мыши2 × 105Олигомицин25 мкМ20 мкл2,5 мкМ
FCCP7,5 мкМ17,6 мкл0,61 мкМ
Ротенон Антимицин Смесь А10 мкМ24 мкл1 мкМ
Нейтрофилы человека4 × 105Олигомицин10 мкМ20 мкл1 мкМ
FCCP12,5 мкМ22 мкл1,25 мкМ
Ротенон Антимицин Смесь А10 мкМ24 мкл1 мкМ
Недифференцированные или дифференцированные клетки HL602.5 × 105Олигомицин25 мкМ20 мкл2,5 мкМ
FCCP15 мкМ22 мкл1,5 мкМ
Ротенон Антимицин Смесь А10 мкМ24 мкл1 мкМ

Таблица 1: Количество клеток и концентрации реагентов для митохондриального стресс-теста.

3. Подготовка соединений в наборе для митохондриального стресс-теста

  1. Откройте набор для митохондриального стресс-теста и подготовьте реагенты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные концентрации рабочего раствора, объем закачки в лунки и конечные концентрации в лунках олигомицина, карбонилцианида-трифторметоксифенилгидразона (FCCP) и смеси ротенона/антимицина А, используемой для нейтрофилов мыши, нейтрофилов человека и клеток HL60, показаны в таблице 1.
    1. Приготовьте исходный раствор олигомицина, восстановив олигомицин 630 мкл анализирующей среды для получения исходного раствора 100 мкМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать стоковый раствор в тот же день.
      1. Приготовьте рабочий раствор олигомицина для анализов нейтрофилов мыши и клеток HL60, смешав 630 мкл исходного раствора с 1,890 мкл анализирующей среды для получения рабочего раствора 25 мкМ.
      2. Приготовьте рабочий раствор олигомицина для анализа нейтрофилов человека, смешав 300 мкл исходного раствора с 2,700 мкл анализной среды для получения рабочего раствора 10 мкМ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание олигомицина с субъединицей Fo базовой пластины АТФазы Fo / F1 (АТФ-синтазы) предотвращает повторное проникновение протонов в митохондрии и ингибирует синтез АТФ32. Это значительно снижает поток электронов через цепь переноса электронов и OCR. Однако поток электронов не прекращается полностью из-за утечки протона через внутреннюю митохондриальную мембрану33.
    2. Приготовьте исходный раствор FCCP, восстановив FCCP с 720 мкл анализирующей среды, чтобы получить исходный раствор 100 мкМ.
      1. Приготовьте рабочий раствор для анализа нейтрофилов мыши, смешав 300 мкл исходного раствора с 3,700 мкл анализной среды для получения рабочего раствора 7.5 мкМ.
      2. Приготовьте рабочий раствор для анализа нейтрофилов человека, смешав 375 мкл исходного раствора с 2,625 мкл анализируемой среды для получения рабочего раствора 12.5 мкМ.
      3. Готовят рабочий раствор для анализа клеток HL60 путем смешивания 720 мкл исходного раствора с 4,080 мкл анализной среды для получения рабочего раствора 15 мкМ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление FCCP показывает максимальную способность митохондрий использовать OXPHOS. Это жирорастворимая, слабая кислота, проницаемая для митохондрий, что приводит к диссипитации трансмембранного потенциала. Разрядка протонного градиента через внутреннюю мембрану митохондрий и отклонение потока протонов от АТФ-синтазы Fo / F1 приводит к развязке митохондрий. Этот эффект разъединения резко увеличивает потребление кислорода митохондриями для сохранения протонного градиента34.
    3. Приготовьте исходный раствор ротенона/антимицина А, восстановив смесь ротенона/антимицина А 540 мкл анализирующей среды для получения исходного раствора 50 мкМ.
      1. Приготовьте рабочий раствор ротенона/антимицина А для всех анализов, смешав 540 мкл исходного раствора с 2,160 мкл анализирующей среды для получения рабочего раствора 10 мкМ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ротенон блокирует комплекс I, ингибируя перенос электронов от железо-серных центров в комплексе I к убихинону, в то время как антимицин А блокирует комплекс III цепи переноса электронов, что приводит к блокаде OXPHOS с ограниченным синтезомАТФ-35. Таким образом, это выявляет немитохондриальное дыхание36,37.
  2. Зарядить картридж реагентами; загрузить подготовленную смесь олигомицина, FCCP и ротенона/антимицина А в порты A, B и C соответственно в картридже для инъекций (рис. 2). Используйте шаблонную вставку, имеющуюся вместе с картриджем, чтобы облегчить загрузку реагентов в порты. Заполните неиспользуемые порты 20 мкл анализирующей среды.
    1. Для анализа нейтрофилов мыши загрузите 20 мкл олигомицина (25 мкМ; каждая лунка 96-луночной пластины имеет 180 мкл анализной среды в начале, таким образом, конечная концентрация составляет 2,5 мкМ) в порты А. Загрузите 17,6 мкл FCCP (7,5 мкМ; конечная концентрация: ~0,61 мкМ) в порты B. Загрузите 24 мкл смеси ротенона/антимицина А (10 мкМ; конечная концентрация: ~1 мкМ) в С-порты.
    2. Для анализа нейтрофилов человека загрузите 20 мкл олигомицина (10 мкМ; каждая лунка 96-луночной пластины имеет 180 мкл анализной среды в начале, таким образом, конечная концентрация составляет 1 мкМ) в порты А. Загрузите 22 мкл FCCP (12,5 мкМ; конечная концентрация: ~1,25 мкМ) в порты B. Загрузите 24 мкл смеси ротенона/антимицина А (10 мкМ; конечная концентрация: ~1 мкМ) в С-порты.
    3. Для анализа клеток HL60 и dHL60 загрузите 20 мкл олигомицина (25 мкМ; каждая лунка 96-луночного планшета имеет 180 мкл анализирующей среды в начале, таким образом, конечная концентрация составляет 2,5 мкМ) в порты А. Загрузите 22 мкл FCCP (15 мкМ; конечная концентрация: ~ 1,5 мкМ) в порты B. Загрузите 24 мкл смеси ротенона/антимицина А (10 мкМ; конечная концентрация: ~1 мкМ) в С-порты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите раствор препарата пипеткой в порт, не касаясь дна порта. Не постукивайте по пластине после загрузки, чтобы избежать утечки, так как жидкости удерживаются капиллярными силами. Фоновые лунки культуральной пластины и порты на картридже датчика загружают пробирной средой или тем же портом загрузки реагентов, что и в пробоотборных лунках, для нормализации влияния реагентов на фоновые значения. Реагенты должны быть добавлены в соответствующие порты, не отрывая картридж от пластины, содержащей калибр, чтобы избежать попадания воздуха. Заполните последний порт всех скважин средой, как показано на рисунке 2.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Картридж для анализа митохондриального стресса и их порты для инъекций. На изображении показан картридж митохондриального стресс-анализа и увеличенное изображение, показывающее загрузку отдельных лекарств / среды в порты. Аббревиатура: FCCP = карбонилцианид-трифторметоксифенилгидразон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Проведение анализа митохондриального стресса

  1. Включите метаболический анализатор и компьютер, откройте программное обеспечение Wave и нажмите « Нагреватель вкл .», чтобы настроить машину на 37 °C не менее чем за 5 часов. После достижения температуры в левом нижнем углу волнового программного обеспечения отображается готовность.
  2. Откройте шаблон для набора для анализа митохондриального стресса в программном обеспечении. Нажмите « Определение группы » в верхней строке меню.
  3. Отдельно предварительно настройте каждое определение с левой стороны, например, стратегии инъекций, предварительные обработки, анализирующие среды и (используемый биоматериал) типы клеток.
  4. Нажмите на стратегии инъекций слева, затем нажмите « Добавить » и назовите условие инъекции как нейтрофилы человека / нейтрофилы мыши / HL60. Выберите порт A-D , щелкнув каждый из них, нажмите « Добавить соединение » и введите олигомицин / FCCP / ротенон антимицин А с соответствующими концентрациями (таблица 1).
  5. Нажмите на предварительную обработку слева, затем нажмите « Добавить » и назовите их как CD18 и Cell Tak отдельно. Нажмите на используемый биоматериал слева, затем нажмите « Добавить » и назовите их как нейтрофилы человека, нейтрофилы мыши и HL60 / dHL60 с плотностью посева.
  6. Определите группы, нажав «Добавить группу» (например, для анализа нейтрофилов человека) и щелкнув по определению, лежащему в его основе (например, стратегии инъекций в соответствии с таблицей 1 «Нейтрофилы человека», «Предварительная обработка» как CD18 и тип клеток как «Нейтрофилы человека»).
  7. Нажмите « Карта плит» в верхнем меню, чтобы увидеть все группы с определениями слева и картой плит справа. Перетащите указатель, чтобы добавить каждую скважину в группу, сохранив при этом четыре угловых колодца в качестве фона (по умолчанию).
  8. Настройте протокол, нажав «Протокол» в верхнем меню, и определите три цикла исходной смеси, олигомицина, FCCP, ротенона и антимицина А, установив время смешивания как 3 минуты, «Отдых» как 0 минут и «Измерение» как 7 минут.
  9. Перейдите на страницу «Выполнить анализ », предоставьте сводную информацию о проекте для справки и нажмите « Начать выполнение».
  10. Укажите место для сохранения файлов, чтобы все результаты были сохранены после завершения анализа.
  11. После автоматической загрузки анализа подождите, пока лоток откроется, чтобы поместить картридж датчика и пластину с калибром 200 мкл (шаг 1.1). Установите направление штрих-кода картриджа вправо. Запустите калибровку, нажав « Я готов», что займет примерно 20 минут.
  12. После калибровки нажмите « Открыть лоток». Замените пластину пластиной, засеянной ячейками, и нажмите « Пластина тензодатчика », чтобы продолжить анализ.
  13. После завершения анализа данные автоматически сохраняются. Нажмите « Просмотреть результаты » и экспортируйте их в виде электронной таблицы или другого файла программного обеспечения для анализа.
  14. Составьте график и проанализируйте данные (рис. 3 и рис. 4).
  15. Рассчитайте параметры дыхания, включая базальное митохондриальное дыхание, дыхание, связанное с утечкой протонов, дыхание, связанное с АТФ, максимальное дыхание, запасную дыхательную способность и немитохондриальное дыхание (рис. 4A)38,39,40,41.
    1. Рассчитайте базальное митохондриальное дыхание, вычтя значение OCR, измеренное после добавления смеси ротенона/антимицина А из OCR перед введением олигомицина (рис. 4A, a).
    2. Рассчитайте дыхание, связанное с утечкой протона, путем вычитания значения OCR после инъекции смеси ротенона/антимицина А из значения OCR, измеренного после инъекции олигомицина (рис. 4A, b).
    3. Оцените дыхание, связанное с АТФ, вычислив разницу между базальным митохондриальным дыханием и дыханием, связанным с утечкой протонов. Вычтите первое значение OCR, измеренное после инъекции олигомицина, из первого значения OCR до инъекции олигомицина (рис. 4A, c).
    4. Максимальное дыхание — это максимальная частота дыхания, которую клетка может достичь после добавления FCCP. Рассчитайте это, вычтя значение OCR после инъекции смеси ротенона/антимицина А из значения OCR, измеренного после инъекции FCCP (рис. 4A, d).
    5. Резервная дыхательная способность относится к способности клетки удовлетворять более высокую потребность в энергии через OXPHOS. Рассчитайте это, найдя разницу между максимальным дыханием и базальным митохондриальным дыханием (рис. 4A, e).
    6. Немитохондриальное дыхание — это количество кислорода, потребляемого немитохондриальными источниками. Измерьте это после добавления смеси ротенона/антимицина А (рис. 4A, f).
  16. Проведите статистический анализ с использованием t-критерия Стьюдента для сравнения различных параметров дыхания недифференцированных и дифференцированных клеток HL60. Считайте, что p < 0,05 является статистически значимым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репликации со значениями OCR или ECAR ниже нуля считаются ошибкой при подготовке образцов, впрыске соединения или измерении. Они исключены из будущего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Показана репрезентативная динамика OCR, указывающая на изменения митохондриального дыхания в ответ на олигомицин, FCCP и смесь ротенона/антимицина А нейтрофилов мыши (рис. 3A), нейтрофилов человека (рис. 3B) и недифференцированных и дифференцированных клеток HL60 (рис. 3C). Во всех клетках лечение олигомицином снижает значение OCR за счет ингибирования протонного канала АТФ-синтазы; Лечение FCCP восстанавливает значение OCR за счет ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стандартная процедура, которая измеряет митохондриальное дыхание нейтрофилов с помощью метаболического анализатора внеклеточного потока, ограничена многими факторами, включая количество клеток, рост клеток и жизнеспособность. Концентрация каждого соединения варьируется в зависимости от типа и источника клеток в этом анализе. Олигомицин и ротенон / антимицин А в основном используются в одинаковой концентрации среди большинства типов клеток. Однако, поскольку максимальная частота дыхания, индуцированная FCCP, варьируется у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы выражаем благодарность доктору Энтони Т. Велле и доктору Федерике Альяноин из отделения иммунологии UConn Health за их обучение использованию анализатора метаболического внеклеточного потока, а также доктору Линн Паддингтон из отделения иммунологии UConn Health за ее поддержку инструментов. Мы выражаем благодарность доктору Женеве Харгис из Медицинской школы Университета Коннектикута за ее помощь в написании и редактировании этой рукописи. Это исследование было поддержано грантами Национального института здравоохранения, Национального института сердца, легких и крови (R01HL145454), Национального института общих медицинских наук (R35GM147713 и P20GM139763), стартап-фонда UConn Health и стипендии Американской ассоциации иммунологов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
37 ° C без CO2  инкубаторПрецизионнаяэкономичная модель 2EGИнструмент
биорендерПрограммное приложение
ЦентрифугаEppendorfМодель 5810RИнструмент
Corning  Клеточный и тканевый адгезив Cell-TakCorning102416-100Реагент
EasySep МагнитSTEMCELL18000Магнит
EasySepMouse Набор для обогащения нейтрофиловSTEMCELL19762AРеагенты
Graphpad Prism 9Программное приложение
Сыворотка крови человека Раствор альбумина (25%)GeminiBio800-120Реагенты
Кетамин (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Анестетик
PBSCytivaSH30256.01
Реагенты Пластинчатые ведраEppendorfUL155Аксессуар
PolymorphPrep PROGEN1895 (предыдущий 1114683)раствор полисахарида
Очищенный мышиный антитело против человека CD18Biolegend302102Клон TS1/18
RPMI 1640 MediumGibco11-875-093Реагенты
Анализатор метаболического внеклеточного потока SeahorseAgilentXFe96Прибор
Seahorse XF Cell Mito Набор для стресс-тестовAgilent103015-100митохондриальный стресс-тест Набор
Ротор с качающимся ведромEppendorfA-4-62Ротор
Vactrap 2 Вакуумная ловушкаFox Lifesciences3052101-FLSПрибор
Волновоепрограммное приложение
XF 1,0 М Раствор глюкозыAgilent103577-100Реагент
XF 100 мМ Раствор пируватаAgilent103578-100Реагент
XF 200 мМ Раствор глютаминаAgilent103579-100Реагент
XF DMEM mediumAgilent103575-100Реагент
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Материал
Ксилазин (AnaSed Injection)DAILYMEDNDC 59399-110-20Анестетик

Ссылки

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136(2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858(2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472(2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521(2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121(2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444(2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487(2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907(2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850(2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465(2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656(2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845(2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975(2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079(2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899(2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608(2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856(2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099(2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306(2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HL60

Похожие статьи