Методическая статья

Вскрытие всей центральной и периферической нервной системы у мышей

DOI:

10.3791/64974

⸱

24 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Functional Genomics, Université de Sherbrooke, 2Department of Dermatology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Department of Pathology, Université de Sherbrooke, 4Centre de Recherche du Centre Hospitalier de Universitaire de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 5Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 6UTSW Comprehensive Neurofibromatosis Clinic, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 7Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для завершения вскрытия центральной и периферической нервной системы мышей. Рассеченные ткани в дальнейшем анализируются в последующих приложениях, таких как общие снимки или гистология.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные модели представляют собой рабочую лошадку в области нейробиологии. Несмотря на это, на сегодняшний день до сих пор не существует пошагового протокола для полного препарирования нервной системы грызуна, а также нет полной схемы, представляющей ее, которая была бы в свободном доступе. Доступны только методы забора головного мозга, спинного мозга, определенного ганглия заднего корешка и седалищного нерва (отдельно). Здесь мы приводим подробные фотографии и схему центральной и периферической нервной системы мышей. Что еще более важно, мы описываем надежную процедуру для выполнения его вскрытия. 30-минутный этап предварительного рассечения позволяет изолировать интактную нервную систему внутри позвонка с помощью мышц, свободных от внутренних органов и кожи. За этим следует 2-4-часовое вскрытие под микроскопом, чтобы обнажить спинной мозг и грудные нервы и, наконец, снять кожуру со всей центральной и периферической нервной системы. Этот протокол представляет собой значительный шаг вперед в изучении анатомии и патофизиологии нервной системы во всем мире. Например, рассеченные ганглии дорсальных корешков из модели мышей с нейрофиброматозом I типа могут быть дополнительно обработаны для гистологии, чтобы выявить изменения в прогрессировании опухоли.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать центральную и периферическую нервную систему мыши в целое целое. В настоящее время не существует протокола для препарирования всей нервной системы грызуна для ее изучения на глобальном уровне. Неврологи обычно используют седалищный нерв в качестве суррогата для любого периферического нерва1, а ганглии от L3 до L52 в качестве суррогата для любых ганглий. Используя эти методы, невозможно сделать вывод, являются ли результаты специфичными для конкретного нерва/ганглия. Поскольку известно, что по крайней мере некоторые нервные патологии поражают не все нервы и ганглии одинаково 3,4,5, необходимо разработать методику, позволяющую изолировать всю нервную систему грызуна для изучения ее глобально.

На протяжении многих лет мы разрабатывали и совершенствовали метод полного препарирования центральной и периферической нервной системы мышей. Первый этап, по сути, представляет собой грубое препарирование мышей в рамках подготовки к этапам микродиссекции под микроскопом. На этапах со 2 по 4 обнажаются спинной мозг и грудные нервы, расчленяется головной мозг, а весь спинной мозг и периферические нервы отделяются от туши.

Этот метод эффективен в сочетании с визуализацией или гистологией для документирования любых макроскопических или микроскопических изменений 6,7,8,9. Нейробиологи, заинтересованные в изучении глобальных изменений или проведении экспериментов, не основанных на гипотезах, должны использовать этот метод для изучения глобальной нервной системы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, учреждением, сертифицированным Канадским советом по уходу за животными.

1. Подготовка к микродиссекции (преддиссекция)

  1. Провести анестезию 5% изофлураном, затем эвтаназию 2% изофлураном и 10 psi CO2 до тех пор, пока не исчезнут жизненные показатели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте вывих шейного отдела, так как это повреждает спинной мозг и шейные ганглии.
  2. Поместите усыпленную мышь лицевой стороной вверх (вид спереди) на подушечку для вскрытия и распылите на шерсть 70% этанола.
  3. Затем прикрепите верхние и нижние конечности, используя четыре булавки малого диаметра, чтобы удерживать мышь в положении во время вскрытия.
  4. С помощью хирургических ножниц разрежьте кожу от нижней части живота до горла.
  5. Снимите кожу, чтобы обнажить внутренние органы, и используйте дополнительные булавки, чтобы сохранить кожу с каждой стороны, обнажая брюшную полость.
  6. Разрежьте грудную клетку, чтобы обнажить сердце и легкие.
  7. С помощью пары стандартных анатомических щипцов захватите пищевод и трахею и разрежьте чуть выше щипцов.
  8. Затем начните отслаивать все внутренние органы в краниально-каудальном доступе. Для этого разрежьте диафрагму вдоль позвоночного столба, чтобы удалить все внутренние органы одним куском.
  9. Отцепите мышь и смойте лишнюю мышиную кровь из брюшной полости в раковине.
  10. Положите мышь лицевой стороной вниз (вид сзади). Прикрепите верхние и нижние конечности, используя четыре булавки, чтобы удерживать мышь в нужном положении во время вскрытия.
  11. С помощью хирургических ножниц сдирайте кожу с головы до задних конечностей.
  12. Обнажите левый седалищный нерв (нижнюю конечность).
    1. Разрежьте мышцы в нижней части левой нижней конечности.
    2. Найдите и обнажите седалищный нерв, удалив мышцу вокруг него.
    3. Осторожно перережьте седалищный нерв на месте разветвления сурального, большеберцового и малоберцового нервов и пощадите кровеносные сосуды.
    4. Продолжайте изолировать седалищный нерв с помощью стандартных анатомических щипцов и очень тонких боннских ножниц, пока он не станет параллельным позвоночному столбу, оставляя свободный нерв около 2 см.
    5. Вставьте хирургические ножницы параллельно спинному мозгу и разрежьте бедро.
    6. Вывихните бедро, раздвинув крестец и бедренную кость пальцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса необходимо часто останавливаться, чтобы аккуратно потянуть седалищный нерв с помощью щипцов, чтобы избежать нарушения.
    7. В конце аккуратно оторвите заднюю конечность от тушки мыши, оставив седалищный нерв длиной около 4 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса найдите нерв L2 и вытащите его из задней конечности, чтобы избежать повреждения L2. Повторите шаг 1.12 для правой стороны.
  13. Обнажите плечевые нервы (верхние конечности).
    1. Манипулируйте тушкой мыши в руках, а не на ровной поверхности (дискотеке).
    2. Найдите левое плечевое сплетение, раздразняв жир и мышцы в левой подмышечной впадине.
    3. После обнаружения разрежьте основные разветвления плечевого сплетения (радиально, подмышечное, надлопаточное) и их подразветвления вокруг локтевой кости очень тонкими боннскими ножницами, оставив свободные нервы около 1,5 см. Аккуратно снимите сплетение с верхней левой конечности.
    4. Вывихнуть верхнюю левую конечность; Убедитесь, что он не нервничает. Повторите шаг 1.13 для правой стороны.
  14. Обнажите мозг.
    1. Теперь положите мышь лицевой стороной вверх (вид спереди)
    2. Вставьте одно лезвие очень тонких боннских ножниц в рот и разрежьте нижнюю челюсть через горло.
    3. Удалите нижнюю челюсть, дополнительно разрезав от щек к горлу.
    4. Затем разрежьте кость черепа, переходящую от одного уха к другому.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проникнуть слишком глубоко и не повредить мозг.
    5. Разрежьте и удалите нёбо и носовые кости, чтобы открыть череп.
    6. Разрежьте позвонок С1 у основания черепа, освободив мозжечок и начало спинного мозга.
    7. Наконец, разрежьте череп поперечно до глаза и удалите части черепа, чтобы обнажить мозг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мозг в полости до тех пор, пока нервы не отклеятся.
  15. Удалите лишний жир или мышцы из туши. Поместите тушу в 10% формалин на 15 минут при комнатной температуре (RT), затем кратко промойте 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) до тех пор, пока не исчезнет фиксирующий запах, и перейдите к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нервная система будет рассечена в течение следующих 2 недель, храните ее при температуре 4 °C в PBS. В противном случае храните его в 10% формалине неопределенно долго. Всегда используйте химический капюшон при работе с формалином.

2. Обнажение спинного мозга

  1. Чтобы обнажить спинной мозг, используйте краниально-каудальный доступ. Чтобы удалить каждый позвонок и его мышечный слой выше, разрежьте в положениях «десять часов» и «два часа» с брюшной стороны, используя пружинные ножницы Ваннас. Откалывайте позвонок с помощью мини-щипцов Дюмона. Продолжайте этот процесс через шейные и грудные позвонки.
  2. Для поясничного отдела разрежьте поперечный отросток с каждой стороны позвонка. Затем разрежьте в положениях «два часа» и «десять часов», вставив лезвие пружинных ножниц Vannas в позвоночный канал. Удалите ткани, уделяя внимание нервам, которые иногда прилипают к костям.
  3. Аналогично действуйте и с хвостовой частью.

3. Воздействие на грудной нерв

  1. Поместите тушу под микроскоп для вскрытия, чтобы визуализировать переднюю сторону.
  2. С помощью пружинных ножниц Vannas разрежьте вдоль каждого ребра (от грудины до нижних конечностей), чтобы обнажить периферические нервы.
  3. Далее разрежьте позвонок с обеих сторон (сбоку) от ганглия, чтобы обнажить ганглий.

4. Отшелушивание периферических нервов

  1. Чтобы отслать спинной мозг и еще больше сместить периферические нервы, с помощью мини-щипцов Дюмонта аккуратно сверните спинной мозг и вытяните нервы один за другим, начиная с каудальной части спинного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед отшелушиванием можно провести дополнительную фиксацию в 10% формалине в течение 15 минут в режиме RT, а затем провести короткое промывание 1x PBS до тех пор, пока не исчезнет фиксирующий запах, как это выполнено на шаге 1.15.
  2. В грудном отделе потяните нерв под углом 90° (перпендикулярно спинному мозгу).
  3. Для плечевого сплетения разрежьте позвонок рядом с нервом, чтобы освободить место для нерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плечевое сплетение не может проходить под позвонком, как в грудном отделе.
  4. Удалите лишние мышцы, чтобы очистить нервы.
  5. Хранить в PBS при температуре 4 °C в общей сложности до 2 недель или неопределенно долго при 10% формалине при RT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грызуны сыграли важную роль в нашем понимании биологии нервной системы и патофизиологии10. Интересно, что ни один метод не представляет собой полного вскрытия центральной и периферической нервной системы грызуна для оценки анатомии и патологических вариаций в модели реального времени 1,2,11. На рисунке 1 представлен обзор этапов с 1 по 4 (подготовка к микродиссекции, обнажени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы мышцы и нервы не высыхали, тушу следует замачивать в PBS каждые 10 минут. При вывихе нижних конечностей (шаг 1.12.6) важно всегда держать в поле зрения сплетение седалищного нерва и L2, чтобы избежать его повреждения/разрыва. При вскрытии мозга (шаг 1.14.4) очень важно избегать слишком глубокого погружения, чтобы не повредить мозг. При рассечении ганглиев дорсальных корешков и периферических нервов в целом крайне важно использовать высококачественные (не поврежденные) мини-щипцы Дю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JPB является научным сотрудником FRSQ J1 и лауреатом премии Early Investigator Research Award от Министерства обороны США. LQL является обладателем награды за карьеру для ученых-медиков от Фонда Burroughs Wellcome и профессора дерматологии Томаса Л. Шилдса, доктора медицинских наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мини-щипцы DumontFine Science Tools#11200-10
Extra Bonn ножницыFine Science Tools#14084-08
Формалин 10%Fischer Scientific#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
Стандартные анатомические щипцыFine Science Tools#91100-12
Хирургические ножницыFine Science Tools#140001-12
Весенние ножницы VannasKent Scientific#INS600124

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи