Структура высшего порядка (HOS) является важным аспектом характеристики белка, поскольку она тесно связана с функцией белка. Масс-спектрометрия (МС) является одним из ключевых методов оценки белка HOS1. Несмотря на то, что подходы, основанные на рассеянном склерозе, не могут определить структуру белка с атомным разрешением, они обладают такими преимуществами, как среднее и высокое пространственное разрешение, высокая специфичность, низкие требования к количеству образцов, высокая пропускная способность и протеомные возможности.
Подходы к белковому следу на основе РС оценивают HOS белка путем анализа доступной для растворителя поверхности белка, и они обычно сочетаются с различными подходами к химическому мечению. Обратимое мечение, например, с помощью водород-дейтериевого обмена (HDX), нацелено на основные амидные водороды в белке 1,2. При необратимом мечении используются либо химические вещества, нацеленные на конкретные аминокислотныеостатки3, либо радикалы, которые маркируют множество различных остатков с более высокой скоростью реакции1. Химическое сшивание также относится к категории необратимых мечений, однако его бивалентная особенность позволяет определять пространственные ограничения между двумя сшитыми сайтами, что дает уникальные топологические выводы 4,5. Все эти подходы могут быть объединены в «набор инструментов», что делает РС ценным инструментом для выяснения белка HOS.
Мы организовали эту коллекцию методов, чтобы представить последние достижения в области анализа белка HOS на основе МС. В первой серии статей представлены подходы, основанные на HDX. Хабиби и Тибодо6 описывают относительно классический непрерывный, восходящий подход HDX-MS. При обмене водорода и дейтерия (H/D) в растворе при многократном обмене с последующим расщеплением пепсина в колонке уровень поглощения дейтерия может быть определен на уровне пептида. При проведении дифференциальных экспериментов (т.е. связанных и несвязанных состояний) пептиды, которые показывают либо повышенный, либо пониженный уровень поглощения дейтерия, представляют области, в которых наблюдаются изменения HOS. Авторы используют лантипептидсинтетазы для наглядной демонстрации рабочего процесса HDX-MS.
Помимо подхода «снизу вверх», HDX-MS также может быть выполнен по принципу «сверху вниз», что позволяет аналитикам применять различные стратегии разделения на уровне интактного белка. Chaihu et al.7 используют капиллярный электрофорез для разделения различных белковых состояний или протеоформ, которые сосуществуют в растворе. Белки подвергаются обмену H/D во время электрофореза во время миграции в капилляре в растворе дейтерированного фонового электролита, после чего следует нисходящий анализ МС и фрагментация газовой фазы для оценки уровней поглощения дейтерия как на глобальном, так и на фрагментном уровнях. Наконец, в этой коллекции есть еще два метода, которые подчеркивают различные методы обмена H/D, а именно обмен на лиофилизированную мощность8 и обмен после ионизации электрораспылением9.
Вторая группа статей посвящена необратимому методу маркировки. Среди них быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) использует радикалы в качестве мечеющих веществ для маркировки поверхности белка10,11. На практике перекись водорода фотоактивируется с помощью лазера с образованием гидроксильных радикалов, которые служат активными мечеющими веществами. Мисра и Шарп12 представляют стратегию радикальной дозиметрии, в которой аденин используется в качестве репортера для радикальной концентрации, а встроенная система радикальной дозиметрии используется для мониторинга адениновой реакции. Это позволяет компенсировать концентрации гидроксильных радикалов в режиме реального времени и, таким образом, нормализовать условия реакции для получения точных показаний. Впоследствии Вайнбергер и Чеа сотрудничали с группой Sharp для разработки безлазерной платформы FPOP13. Заменив опасный лазер плазменным источником света и объединив его со встроенной радикальной дозиметрией и автоматизированной системой сбора образцов, они разработали и предоставили интегрированное решение для исследователей, которым необходимо охарактеризовать белковую HOS.
В трех статьях группыДжонса 14,15,16 исследуется возможность использования FPOP и белкового следа в исследованиях in vivo. Преимущество такого подхода беспрецедентно, так как он позволяет анализировать белок HOS в нативной среде. Успешное применение футпринтинга в клетках14 и Caenorhabditis elegans15 открывает новые возможности для отслеживания HOS всего протеома в его нативном состоянии, что позволяет глубоко понять HOS белка, что не может быть достигнуто с помощью других инструментов.
Еще одним важным методом необратимого мечения являются химические реагенты, нацеленные на конкретные аминокислотные остатки3. Kirsch et al.17 сообщают о хорошо используемом рабочем процессе по выделению белкового следа с помощью ковалентного мечения. Используя диэтилпирокарбонат в качестве реагента для мечения, авторы исследуют изменения в белке HOS, мечая несколько видов аминокислотных остатков на поверхности белка. Благодаря дифференциальным экспериментам с последующим протеолитическим разложением и восходящим анализом МС, рабочий процесс позволяет идентифицировать изменения в доступности растворителей, которые напрямую связаны с изменениями HOS.
Наконец, химическое сшивание является еще одним важным подходом, при котором используются бивалентные химические реагенты для мечения белков 4,5. Химические сшивающие агенты используются для сшивания двух белков, которые пространственно близки друг к другу и, зачастую, образуют структурный комплекс. Haupt et al.18 сообщают о протоколе, в котором они демонстрируют использование химических сшивающих агентов для понимания архитектуры белковых комплексов. Комплекс сшитых белков может быть проанализирован на двух различных уровнях. Посредством протеолитического расщепления с последующей идентификацией РС сшитые дипептиды выявляют взаимодействующие участки белкового комплекса. При анализе сшитого образца через интактную массу стехиометрическая информация о белковых субъединицах в комплексе легко доступна.
Подводя итог, можно сказать, что за последние три десятилетия мы стали свидетелями значительного развития инструментов на основе РС для анализа белка HOS. Необратимый и обратимый след в сочетании с анализом РС дополняют друг друга, и вместе они вносят значительный вклад в характеристику белка HOS. Работы, вошедшие в эту коллекцию методов, представляют собой передовые методы в области анализа белка HOS на основе МС; эти исследования являются ценным ресурсом для исследователей, которые пытаются использовать подходы, основанные на рассеянном склерозе, для ответа на критические вопросы. С более широкой точки зрения, включение данных о контуре в структурные прогнозы имеет решающее значение для преодоления предела пространственного разрешения в методах, основанных на MS. Существуют пионерские работы, которые демонстрируют целесообразность такого подхода 19,20. Кроме того, интеграция платформ также имеет решающее значение, поскольку эти подходы дополняют друг друга и позволяют получить представление с разных точек зрения 21,22. Методы, представленные в этой подборке, демонстрируют силу такой интеграции, и в этом направлении будет продолжаться развитие. Благодаря всем этим достижениям подход, основанный на рассеянном склерозе, вышел за рамки определения молекулярной массы, и в ближайшие десятилетия в этой области будет наблюдаться непрерывный рост.