$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Биомолекулярные взаимодействия являются ключевыми участниками биологических процессов и, таким образом, фундаментально важным аспектом наук о жизни. Флуоресцентные методы стали одними из самых мощных и широко применяемых методов для исследования и понимания этих процессов. Флуоресцентные подходы in vitro открывают возможности для обнаружения вне- и внутриклеточных молекулярных взаимодействий в режиме реального времени, что является основным преимуществом по сравнению с другими подходами. Это было использовано для различных белок-белковых, белок-нуклеиновых кислот и белково-мембранных взаимодействий, которые играют решающую роль в регуляции клеточных процессов.
Эта коллекция дает обзор различных флуоресцентных методов и приложений для изучения биомолекулярных взаимодействий и расширяет наше понимание клеточных процессов.
Райзер и др.1 описывают высокопроизводительный метод анализа клеточной кинетики отдельных клеток с помощью автоматизированного сбора и обработки изображений (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Используя этот метод, флуоресцентные репортеры обеспечивают считывание с временным разрешением различных независимых биологических процессов, таких как экспрессия гена одной клетки после трансфекции, клеточный ответ в сигнальных каскадах, апоптотические события или дифференцировка стволовых клеток. Авторы выполняют визуализацию в изолированных клеточных массивах с помощью сканирующей покадровой микроскопии, что приводит к сотням траекторий одиночных клеток и достаточному количеству данных для статистического анализа. Временные следы флуоресценции отдельных клеток помогут исследователям лучше понять механизмы доставки генов и решить проблему клеточной гетерогенности, которая является отличительной чертой сложных биологических систем, обычно продиктованных внутренними флуктуациями.
Konate et al.2 сообщают о биофизическом методе для характеристики взаимодействия, возмущения и/или пермеабилизации пептидов, взаимодействующих с мембраной. В своем протоколе они точно описывают различные этапы формирования и очистки липосом и характеризуют утечку флуоресценции. Метод применяется с проникающим в клетки пептидом (CPP) под названием WRAP в ассоциации с малой интерферирующей РНК (siRNA) или в сочетании с мощным терапевтическим пептидом (iCAL36) и сравнивается с хорошо известным CPP, пенетратином. Этот метод имеет множество преимуществ. Это быстро и просто в реализации. Это позволяет жестко контролировать состав липидной мембраны, чтобы имитировать различные типы клеточных мембран. Флуорофоры могут быть адаптированы в зависимости от интересующего пептида и его свойств утечки через мембрану. Наконец, образец чрезвычайно стабилен после подготовки. Универсальность метода делает его полезным подходом к исследованию различных биологических вопросов, касающихся повреждения клеток или доставки лекарств.
Присутствие фосфатидилсерина (ФС) в клеточных мембранах млекопитающих важно для различных сигнальных процессов, таких как апоптоз клеток или рекрутирование белков для восстановления мембран. Перенос и изменение распределения PS на поверхности плазматических мембран являются ключевым вопросом, который Ikhlef et al.3 решают в своей статье. Они описывают протокол измерения в режиме реального времени транспорта и обмена липидов PS и PI-4-P рекомбинантным белком дрожжей Osh6p. В методе используются флуоресцентные сенсоры для определения того, экстрагирует ли белок переноса липидов (LTP) или переносит липиды в искусственных мембранах вдоль градиента между липидными везикулами. Этот протокол позволяет работать с немечеными липидами, чтобы обеспечить правильное связывание липидов с LTP. Кроме того, достигается лучшее временное разрешение по сравнению с традиционными методами, такими как радиоактивные анализы или масс-спектрометрия. Этот метод поможет исследователям лучше понять экстракцию и обмен липидами между различными органеллами и мембранами.
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является мощным методом изучения биомолекулярных систем. Этот метод может быть применен к отдельным молекулам (например, smFRET) и позволяет измерять абсолютные расстояния внутри биомолекул. Абдельхамид и др.4 представляют пошаговый протокол о том, как выполнить smfBox, недавно разработанную конфокальную установку, способную измерять эффективность FRET между двумя красителями на свободно диффундирующих одиночных молекулах. В них показано, как внедрить и использовать технику smFRET от подготовки образца до настройки прибора, юстировки, сбора и анализа данных. Кроме того, они описывают, как определить поправочные коэффициенты, необходимые для точных измерений расстояний, полученных с помощью FRET. В данном случае метод применяется к свободно диффундирующим дуплексам ДНК и может быть расширен для широкого спектра применений, таких как изучение конформационных изменений белка или взаимодействия белка с ДНК.
Биологические процессы включают в себя очень разнообразные и многочисленные биомолекулярные взаимодействия, которые оставляют достаточно места для разработки новых флуоресцентных анализов или сенсоров. Эта коллекция предлагает исследователям обзор инноваций и разработок в области методов на основе флуоресценции. Каждая статья проливает свет на отдельный метод, основанный на флуоресценции, подчеркивая, насколько важными и универсальными стали флуоресцентные анализы. В сборнике описываются эти методы и тем самым поощряется их широкое использование в различных группах и областях исследований.