$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Исторически сложилось так, что ученые в значительной степени полагались на исследования на животных, чтобы определить, является ли медицинский продукт (т.е. лекарство или медицинское устройство) безопасным, прежде чем тестировать его на людях. Хотя испытания на животных по-прежнему оправданы во многих ситуациях, поиск альтернатив крайне желателен. С последними достижениями в науке и технике разработка альтернатив испытаниям на животных стала более реальной, чем когда-либо. Возобновление внимания к разработке альтернативных методов оценки безопасности сердечной системы in vitro человека, по крайней мере частично, связано с достижениями в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Клетки сердца человека могут быть получены в лабораторных условиях с использованием простого образца крови или кожи пациента, в результате чего получаются индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (iPSC-CM), подходящие для надежного высокопроизводительного тестирования. Прогресс в области 3D-биоинженерии тканей, технологий микроэлектродных матриц, визуализации живых клеток и других технологий также сыграл важную роль в разработке протоколов, включенных в эту коллекцию.
Протокол Gerges et al.1 применяет неинвазивный оптический метод (MyoBLAZER) для оценки изменений сократимости кардиомиоцитов первичного желудочка взрослого человека. Клетки имеют электрический темп, а анализ изображений измеряет укорочение саркомера в нескольких ячейках параллельно. Этот метод позволяет собирать кривые «концентрация-реакция» каждые 30 минут на каждое соединение на устройство и предоставляет данные о взаимосвязи «структура-активность». Этот неинвазивный оптический метод помогает сохранить физиологию и фармакологию кардиомиоцитов взрослого человека при проведении высокопроизводительного скрининга. Кроме того, использование кардиомиоцитов взрослого человека может обеспечить критически важную трансляционную часть прогнозирования сократимости.
Методология Lickiss et al.2 представляет собой гибридную технологию сократимости и импеданса/потенциала внеклеточного поля (EFP), добавляя значительные функции прозрелости к стандартной отраслевой платформе на 96 лунок за счет использования мягкого, гибкого субстрата клеточной культуры на основе кремния. Этот подход оказался успешным в восстановлении физиологического положительного инотропного ответа на изопротеренол в коммерчески доступных здоровых ИПСХ-КМ, который сознательно отсутствует в стандартной (жесткой субстрате) культуре без необходимости использования 3D-системы. Гибридная система позволяет напрямую измерять силу сжатия (мН/мм2), скорость биения, а также плотность и целостность монослоя ячейки. Кроме того, она решает проблемы традиционной 3D-системы (т.е. низкую пропускную способность, значительные потребности в обучении), сокращая время и затраты, необходимые для проведения анализа.
Коллекция также включает работу Feaster et al.3, которые демонстрируют in vitro, высокопроизводительный, неинвазивный метод оценки терапии модуляции сердечной сократимости (CCM) в 2D-кардиомиоцитах стволовых клеток человека, размещенных на гибком матрасе Matrigel, с использованием видеомикроскопии без зондов. Авторы подчеркивают острое влияние КМК на сократительные свойства здоровых и больных ИПСХ-КМ. Этот инструмент предлагает недорогой метод понимания безопасности или эффективности КМК, а также может снизить зависимость от исследований на животных и помочь в принятии нормативных решений по медицинским устройствам для электрофизиологии сердца.
Усовершенствованный протокол Schaefer et al.4 описывает новое расширение стандартной системы микроэлектродной матрицы (MEA), которая обычно регистрирует потенциал внеклеточного поля в hiPSC-CM, позволяя регистрировать внутриклеточный потенциал действия путем открытия клеточных мембран наносекундными импульсами лазерного луча. Это устройство не только обладает стандартными преимуществами MEA (т.е. мониторинг распространения сигнала, острые и хронические эксперименты), но и позволяет получить представление о форме внутриклеточного потенциала действия без использования сильных импульсов электрического поля для электропорации клеток.
Протокол Берри и др.5 описывает новую платформу, которая позволяет воспроизводить 3D-инженерные мышечные ткани (ЭМТ) для прямых измерений силы сократимости. Прибор может обнаруживать микроньютонные изменения силы сократительной способности, что делает его мощным инструментом для дозозависимого скрининга соединений. Сократительная способность сердечной ткани на основе ИПСК, а также скелетных мышечных тканей может быть зарегистрирована в 24 тканях одновременно, и данные могут быть проанализированы в течение нескольких недель или месяцев. Поэтому от исследователей требуются минимальные дополнительные навыки или обучение.
Наконец, в публикации Zhao et al.6 описывается ряд функциональных анализов (потенциал внеклеточного поля, потенциал действия, сократительная способность и кальций), оптимизированных для использования с кардиомиоцитами, которые могут быть созданы в собственных лабораториях пользователей. Это можно сделать с помощью ранее опубликованных протоколов дифференцировки и ИПСК, доступных в биобанке Института сердечно-сосудистых заболеваний Стэнфордского университета (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), предоставляя широкий спектр «больных» и контрольных клеток. Это полный набор методов для регистрации основных показателей сократительной способности сердца и электрофизиологии, включая стандартные подходы (патч-зажим, микроэлектродные матрицы, кальциевые чувствительные флуоресцентные зонды, видеоизмерения сократительной способности).
В заключение следует отметить, что, хотя нынешняя коллекция методов не претендует на полноту (и продолжает расти), она уже представляет собой относительно всеобъемлющий набор методов, иллюстрирующих многие современные проблемы сократительной способности и электрофизиологических записей в кардиомиоцитах человека. Он включает в себя протоколы для первичных кардиомиоцитов человека1, коммерчески доступные hiPSC-CM, полученные от здоровых доноров 2,3,4, а также протоколы, оптимизированные для клеток, несущих сигнатуру врожденного порока сердца 3,6. Эти методы охватывают различные условия культивирования клеток, от одиночных клеток для экспериментов с зажимом пластыря6 до обычных 2D-монослоев hiPSC-CM на жестких субстратах 1,4, 2D-монослоев кардиомиоцитов на мягких, гибких субстратах 2,3 и, наконец, 3D-инженерных тканейсердца 5. В включенных методах используются различные подходы для регистрации наиболее значимых параметров физиологии сердца, таких как сократительная способность (измеряется либо косвенно с помощью видеоанализов 1,3,6, либо напрямую с помощью сократительной силы 2,5), потенциал действия (в одной клетке с использованием патч-зажима6, потенциалы суррогатного внеклеточного поля с MEA 4,6или с помощью нового подхода к порации клеток для записи потенциально подобных записей действия с помощью стандартной системы MEA4) и кальциевых переходных процессов (с использованием чувствительных к кальцию зондов6). Взятые вместе, эти методы обеспечивают не только подробные протоколы, которые могут быть воспроизведены в других лабораториях, но и иллюстрируют некоторые проблемы, связанные с сердечными методами in vitro человека, такие как: незрелость hiPSC-CM, особенно при использовании стандартной 2D-культуры на жестком субстрате; нежелательные эффекты флуоресцентных потенциал-чувствительных или кальциевых зондов; низкая пропускная способность записи обычных потенциалов действия; трудности в интерпретации стандартных записей потенциальной длительности поля; и отсутствие анализов для оценки медицинских изделий (например, в сравнении с лекарственными препаратами). Отрадно видеть, как много лабораторий работают над усовершенствованием этих методов, что неизбежно приведет к широкой адаптации этих методов в будущем.