Здесь мы представляем протокол для выполнения цельноклеточного пластыря на срезах мозга, содержащих нейроны кисспептина, первичный модулятор клеток гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Добавляя знания об активности кисспептиновых нейронов, этот электрофизиологический инструмент послужил основой для значительных достижений в области нейроэндокринологии за последние 20 лет.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гипоталамические кисспептиновые нейроны как мишень для записи цельноклеточных пластырей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кисспептины необходимы для созревания оси гипоталамо-гипофиз-гонад (HPG) и фертильности. Нейроны гипоталамического кисспептина, расположенные в передневентральном перивентрикулярном ядре и ростральном перивентрикулярном ядре, а также дугообразное ядро гипоталамуса, проецируются на нейроны гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и другие клетки. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов кисспептина происходит через рецептор Kiss1 (Kiss1r), в конечном итоге возбуждая активность нейронов ГнРГ. У людей и экспериментальных животных кисспептины достаточны для индукции секреции ГнРГ и, следовательно, высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ) и гормона-стимулятора фолликулов (ФСГ). Поскольку кисспептины играют важную роль в репродуктивных функциях, исследователи работают над тем, чтобы оценить, как внутренняя активность нейронов гипоталамуса кисспептина способствует действиям, связанным с размножением, и определить первичные нейротрансмиттеры / нейромодуляторы, способные изменять эти свойства. Метод цельноклеточного пластыря стал ценным инструментом для исследования активности нейронов кисспептина в клетках грызунов. Этот экспериментальный метод позволяет исследователям регистрировать и измерять спонтанные возбуждающие и тормозные ионные токи, мембранный потенциал покоя, возбуждение потенциала действия и другие электрофизиологические свойства клеточных мембран. В настоящем исследовании рассматриваются важнейшие аспекты метода цельноклеточного пластыря, известные как электрофизиологические измерения, определяющие гипоталамические кисспептиновые нейроны, и обсуждение соответствующих вопросов о методе.
Введение
Ходжкин и Хаксли сделали первую внутриклеточную запись потенциала действия, описанного в нескольких научных исследованиях. Эта запись была выполнена на аксоне кальмара, который имеет большой диаметр (~ 500 мкм), что позволяет поместить микроэлектрод внутрь аксона. Эта работа предоставила большие возможности для научных исследований, которые впоследствии завершились созданием режима напряжения-зажима, который был использован для изучения ионной основы генерации потенциала действия 1,2,3,4,5,6,7,8.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу и выполнялись в соответствии с этическими принципами, принятыми Бразильским колледжем экспериментов на животных.
1. Приготовление растворов
- Приготовление внутреннего раствора
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний раствор заполняет микропипетку с пластырем и контактирует с внутренней частью клетки (см. пример на рисунке 2). Внутренние решения могут варьироваться в зависимости от типа измеряемой активности33.- Выбирайте внутреннее решение с учето....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для изучения возможного влияния человеческого рекомбинантного гормона роста (hGH) на активность гипоталамических кисспептиновых нейронов мы провели запись цельноклеточного пластыря в срезах мозга и оценили, вызывает ли этот гормон острые изменения активности нейронов AVPV/PeN Kisspeptin и ARHkisspeptin. В этом исследовании использовались взрослые самки Kiss1-Cre / GFP (стадия диэструса) и самцымышей 36. Для экспериментов были отобраны интактные гонадные животные, так как свой.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Развитие метода цельноклеточного пластыря оказало значительное влияние на научное сообщество, считаясь чрезвычайно важным для развития научных исследований и создания нескольких открытий. Его влияния на науку было достаточно, чтобы кульминацией стала Нобелевская премия по медицине в 1991 году, поскольку это открытие открыло дверь к лучшему пониманию того, как ионные каналы функционируют в физиологических и патологических условиях, а также к выявлению потенциальных мишеней для терапевтических агент.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих декларированию.
Благодарности
Это исследование было поддержано Исследовательским фондом Сан-Паулу [номера грантов FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Финансовый кодекс 001» (HRV).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Соединения для аКСФ, внутренние и нарезные растворы | |||
| АТФ | Sigma Aldrich/различные | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/различные | C7902 | |
| D-(+)-глюкоза | Sigma Aldrich/различные | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/различные | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/различные | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/различные | P5405 | |
| K-глюконат | Sigma Aldrich/различные | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/различные | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/различные | M9272 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich/различные | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/различные | S5886 | |
| 2PO4 | Sigma Aldrich/различные | S5011 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich/различные | S5761 | |
| азотная кислота | Sigma Aldrich/различные | 225711 | ОСТОРОЖНО |
| Сахароза | Sigma Aldrich/различные | S1888 | |
| Equipments | |||
| Air table | TMC | 63-534 | |
| Усилитель | Молекулярные приборы | Multiclamp 700B | |
| Компьютер | различный-DIGIDATA | ||
| 1440 МАЛОШУМЯЩАЯ СИСТЕМА СБОРА ДАННЫХ | Молекулярные приборы | DD1440 | |
| Цифровой перистальтический насос | Ismatec | ISM833C | |
| Клетка Фарадея | TMC | 81-333-03 | |
| Камера визуализации | Leica | DFC 365 FX | |
| Микроманипулятор | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| Съемник микропипеток | Narishige | PC-10 | |
| Микроскоп | Leica | DM6000 FS | |
| Остеотомный | Bonther оборудование и Технология/различные | 128 | |
| Восстановительная камера | Warner Instruments/Гарвардский аппарат | - | могут быть изготовлены на собственном производстве |
| Записывающая камера | Warner Instruments | 640277 | |
| Шпатель | Fisher Scientific/различные | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
| Вибратом | Водяная баня Leica | VT1000 S | |
| Программное обеспечение и системы Fisher Scientific /различные | Isotemp | ||
| и системы обеспечение strong> | |||
| AxoScope 10 | Программное обеспечение Molecular | Devices-Commander | |
| LAS X широкоугольная система | Leica-Сбор | и анализ изображений | |
| MultiClamp 700B | Молекулярные устройства | MULTICLAMP 700B | Commander Программное обеспечение |
| PCLAMP 10 ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДЛЯ WINDOWS | Молекулярные приборы | Pclamp 10 Стандартный | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl электрод, гранула, 1,0 мм | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Изогнутый гемостатический щипец | |||
| клей | LOCTITE/различный | ||
| Ножницы для обезглавливания | разные-Фильтровальная | ||
| бумага различная-Стеклянные | |||
| капилляры (микропипетки) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| Ножницы для радужной оболочки | глаза Bonther оборудование и Tecnologia/различные | 65-66 | |
| Стеклянные пипетки Пастера | Sigma Aldrich/различные | CLS7095B9-1000EA | |
| чашка Петри | различная-Полиэтиленовые | ||
| трубки | Warner Instruments | 64-0756 | |
| Бритвенное лезвие для рассечения мозга | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| Бритвенное лезвие для вибратома | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| Ножницы | Bonther equipamentos & Технология/разное | 71-72, 48,49; | |
| силиконовая соска | различная-Slice | ||
| Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
| Шприцевые фильтры | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 m |
| Пинцет | Bonther equipamentos & Технология/Разное | 131, 1518 |
Ссылки
- Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
- Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
- Gandini, M. A., Sandoval, A., Feli....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
