Питающиеся кровью членистоногие, такие как комары, клещи и москитные мухи, переносят несколько значимых с медицинской точки зрения патогенов, многие из которых недостаточно изучены и не имеют адекватной терапии. Поэтому для предотвращения передачи болезни часто требуется нацеливание на членистоногих1. Например, комплексная борьба с переносчиками болезней (КБПБ) представляет собой комплексную структуру, направленную на повышение эффективности традиционных методов борьбы с переносчиками, таких как инсектициды, путем их дополнения более инновационными методами, такими как генетический контроль2. В этой специальной коллекции рассказывается о разнообразии трансгенных членистоногих, создаваемых для изучения трансмиссивных болезней и борьбы с ними, а также о технических и творческих навыках, необходимых для создания таких генетически модифицированных организмов.
Отношения членистоногие-патоген-хозяин развиваются в течение многих лет, формируя генетику всех затронутых видов 3,4,5. Модельные системы, как правило, недостаточны для изучения членистоногих, питающихся кровью, потому что их биология и поведение специфичны для вида. Молекулярные энтомологи должны воссоздать сложную среду, которая позволяет питаться кровью и размножаться, чтобы отдельные виды можно было регулярно поддерживать и изучать в лаборатории в контролируемых условиях. Выращивание членистоногих гематофагов требует как биологических знаний, так и «тщательного внимания квалифицированных специалистов»6. По этой причине неудивительно, что векторная биология находится на переднем крае генетических инноваций.
Несмотря на то, что этот специальный выпуск посвящен созданию трансгенных членистоногих в различных родах, возникает одна центральная тема: этот процесс требует пристального внимания к деталям, четкого понимания биологии организма и изобретательного мышления. Louradour et al.7 подчеркивают проблемы адаптации методов эмбриональной микроинъекции к переносчикам паразитов Leishmania, а именно к песчаным мухам, которые откладывают очень мелкие яйца. Свежеснесенные яйца перекладывают на отдельные кусочки черной фильтровальной бумаги на предметное стекло микроскопа с покровным стеклом и аккуратно выстраивают для микроинъекций. Уровень влажности, качество подготовленных материалов и тщательность, с которой выполняется процесс, — это лишь несколько переменных, определяющих, будет ли техника успешной. Жесткая микроинъекция яйцеклетки клеща сопряжена с определенным набором проблем – толстый внешний слой воска на эмбрионах, твердый хорион и высокое внутриовальное давление8. Sharma et al. описывают процедуры у Ixodes scapularis, которые преодолевают эти препятствия путем удаления воскового слоя, размягчения хориона и высыхания яиц8. К ним относятся удаление органа Гене (восковой железы) у самок, откладывающих яйца, сбор яиц в течение 24 ч после откладки, а затем помещение яиц в 1% раствор хлорида натрия примерно на 1 ч перед микроинъекцией.
Можно обойти эмбриональные микроинъекции, вводя куколкам или взрослым особям механизм, который редактирует или подавляет гены. Benetta et al. описывают эту технику с использованием двух методов доставки яичников – рецептор-опосредованной яичниковой трансдукции груза (ReMOT Control) или разветвленных амфифильных пептидных капсул (BAPC), а также двух стратегий инъекций (либо фемтоджет, либо аспираторная трубка) паразитической осе Nasonia vitripennis9. Куколки выстраивали в линию и прикрепляли к предметному стеклу микроскопа с помощью клея, чтобы облегчить процесс инъекции и снизить смертность9. Взрослых, с другой стороны, обезболивали льдом, чтобы пользователь мог поддерживать самку щипцами во время инъекции в живот.
В дополнение к CRISPR/Cas9-опосредованному редактированию генов, в этом выпуске рассматриваются и другие технологии генной инженерии, используемые в членистоногих, включая сайт-направленную φC31-рекомбиназу и GAL4-UAS. Первый, описанный Adolfi et al., обеспечивает сайт-направленную интеграцию трансгенного груза attB-flanked для одиночной интеграции или рекомбиназ-опосредованного кассетного обмена у переносчиков малярии Anopheles gambiae и Anopheles stephensi10. Эта технология позволяет осуществлять направленное на место внедрение в ранее установленные стыковочные линии, что упрощает валидацию, избегая позиционных эффектов и последующих схем спаривания, необходимых для стабильной генетической линии10. Другой метод, двудольная система GAL4-UAS, используется Poulton et al. для получения трансгенных Anopheles gambiae , которые экспрессируют трансгенные кассеты пространственно-временным, тканеспецифичным образом, даже за счетсерьезных затрат на физическую подготовку. Благодаря своей гибкости эта система позволяет исследователям проводить скрининг фенотипов и делать выводы о функциях генов, которые в противном случае были бы невозможны.
Действительно, трансгенный груз часто сопряжен с издержками приспособленности членистоногого; поэтому Williams et al. изложили простые протоколы для измерения затрат на приспособленность у трансгенных комаров Aedes aegypti 12. К ним относятся плодовитость, размер и форма крыльев, фертильность, соотношение полов, жизнеспособность, время развития, вклад самцов и продолжительность жизни взрослыхособей. Такие измерения приспособленности могут быть использованы для сравнения здоровья трансгенных комаров, полученных в ходе исследований, или для моделирования скорости фиксации трансгенов в математических моделях.
Методологические детали в этих рукописях визуально иллюстрированы для облегчения воспроизведения. Представлены различные молекулярные и энтомологические методы: определение пола и скрининг куколок комаров на флуоресцентные маркеры11,12; комбинирование и очищение донора и хелпера φC31 плазмидных смесей10; инъекции взрослым драгоценным осам внутрибрюшной полости9; выравнивание яиц песчаных мух для микроинъекций7; и абляция восковых желез клеща8. Учитывая широту методов, рассмотренных в этом специальном выпуске, как любителям, так и экспертам предлагается взглянуть на основы создания генетически модифицированных членистоногих. Эти методы являются основой для изучения физиологии членистоногих и взаимодействия переносчиков и патогенов, что имеет важное значение для разработки новых стратегий, снижающих трансмиссивные заболевания.