Глаз содержит прозрачные среды, в которых отсутствуют кровеносные сосуды, включая роговицу, хрусталик глаза и стекловидное тело. Свет должен пройти через эти среды, прежде чем достичь фоторецепторов в задней части сетчатки. В частности, роговица, хрусталик глаза и стекловидное тело лишены кровеносных сосудов, чтобы избежать поглощения света и искажения изображений1. Кровеносные сосуды сетчатки организованы в три слоя: поверхностный слой, который простирается от диска зрительного нерва до периферии внутри слоя нервных волокон; средний слой, который находится внутри внутреннего плексиформного слоя; и глубокий слой, который распределяется через внешний плексиформный слой. Эта сосудистая сеть снабжает кровью внутреннюю часть сетчатки, в то время как фоторецепторы снабжаются путем диффузии из кровеносных сосудов хориоидеи. Питание внутренней и внешней сетчатки строго контролируется внутренним и внешним гемато-ретинальными барьерами (BRB). Эндотелиальные клетки сетчатки, перициты и глиальные клетки составляют внутренний BRB. С другой стороны, клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), эндотелиальные клетки хориоидеи и мембрана Бруха образуют наружный BRB. Патологические изменения кровеносных сосудов сетчатки являются отличительными чертами ряда заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация и ретинопатия недоношенных. Эти патологические изменения включают, помимо прочего, воспаление сосудов, разрушение BRB, капиллярную дегенерацию, изменения кровотока сетчатки и патологическую неоваскуляризацию сетчатки (РНВ)2,3,4. Поэтому важно разработать эффективные методы изучения этих изменений как in vivo на экспериментальных животных, так и in vitro путем культивирования различных клеток сетчатки в условиях, схожих с биологической и биохимической средой при заболевании человека. Исследователи могут использовать несколько экспериментальных подходов для анализа основных молекулярных и клеточных механизмов сосудистых заболеваний сетчатки. Целью данной коллекции методов является обмен с другими исследователями опытом ученых-офтальмологов и офтальмологов в области методов изучения нормального развития сосудов и сосудистых аномалий при различных заболеваниях сетчатки.
В статье Damsgaard et al. представлен ультразвуковой метод с усилением потока, который позволяет исследователям визуализировать сосудистую сеть глаза в трех измерениях без использования контрастных веществ. Этот метод преодолевает ограничения других методов благодаря своей стабильности при визуализации глаза за пигментированной сетчаткой. Хотя метод был продемонстрирован на золотых рыбках, он может быть применен ко всем другим экспериментальным видам с ядром эритроцитов. Этот метод ценен для визуализации глазных кровеносных сосудов в нормальных и патологических условиях и может быть полезен для изучения глазного кровотока. Однако этот метод ограничен отсутствием ядросодержащих эритроцитов у млекопитающих. Таким образом, по сравнению с видами с ядрами эритроцитов, ультразвук, усиленный потоком, дает контраст кровотока только у млекопитающих. Кроме того, этот метод чувствителен к шуму движения, например, от дыхательных движений, который может создавать размытые изображения и артефакты. Этот шум движения может быть отрегулирован с помощью проспективного или ретроспективного стробирования. Как для 2D, так и для 3D съемки крайне важно ограничить артефакты движения, вызванные движением животного из-за неадекватной анестезии или нестабильной настройки датчика. Развитие этого метода открывает путь к неинвазивному исследованию in vivo глубоких сосудистых сетей в глазу у подавляющего большинства позвоночных, обладающих эритроцитами с ядрами.
Метод, представленный Macouzet-Romero et al., оценивает относительный вклад сосудов сетчатки в плотность макулярной перфузии с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ)-ангиографии6. Этот метод характеризует долю участка с кровообращением от расширенных сосудов. Следует отметить, что расширение сосудов может быть реакцией на патологические состояния. Этот подход может косвенно определить вазодилатацию и косвенно выявить низкую оксигенацию при сосудистых заболеваниях сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия (ДР), окклюзия центральной вены или возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Используя этот метод, основные выводы Macouzet-Romero et al.6 заключались в том, что вклад сосудов, превышающих капилляры сетчатки, в кровообращение сетчатки составил 18,2% у здоровых людей. Таким образом, этот процент может быть использован в качестве ориентира для выявления ранних изменений плотности перфузии из-за сосудистых заболеваний сетчатки. Например, процентный вклад составил 2,6% у пациентов с артериальной гипертензией и 16,4% у пациентов с сахарным диабетом, что позволяет предположить, что этот метод потенциально может быть использован для оценки прогрессирования заболеваний сетчатки, связанных с сосудистыми аномалиями.
Метод, представленный Subirada et al., оценивает различные параметры сосудистых изменений (степень капиллярной дегенерации [аваскулярные участки], патологическую неоваскуляризацию сетчатки [неоваскулярные участки], дилатацию и извитость артериол сетчатки) в экспериментальных моделях ишемических ретинопатий, таких как кислород-индуцированная ретинопатия (ОИР) и экспериментальный диабет7. Следует отметить, что ОИР воспроизводит ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии. Возможность количественной оценки степени неоваскуляризации сетчатки (РНВ) или капиллярной дегенерации в экспериментальных моделях имеет решающее значение для изучения основных молекулярных и клеточных механизмов, а также для тестирования возможных терапевтических эффектов фармакологических или молекулярных вмешательств. Подводя итог, можно сказать, что в этой статье представлены классические, хорошо зарекомендовавшие себя и воспроизводимые методы количественной оценки некоторых из наиболее актуальных сосудистых параметров, рассматриваемых в клинической практике.
В статье Vaglienti et al. представлены методы измерения уровней активных форм кислорода (АФК) в глиальных клетках Мюллера8. Роль окислительного стресса в микрососудистой дисфункции сетчатки при ишемических ретинопатиях была установлена и побудила исследователей изучить степень, в которой активные формы кислорода (АФК) способствуют расщеплению BRB и RNV как in vivo, так и in vitro 9,10,11,12. Vaglienti et al. используют 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетат (DCFD) для оценки уровней внутриклеточной генерации активных форм кислорода (АФК). Этот метод основан на диффузии DCFD в клетку и последующем окислении DCFD АФК до 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF). DCF обладает высокой флуоресцентностью и может быть обнаружен с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать и измерять уровни образования АФК как в клетках, так и в тканях сетчатки.
В статье Tomaszewski et al. показано выделение и рост клеток пигментного эпителия (RPE) сетчатки мыши13. Клетки RPE вносят свой вклад во внешний BRB и играют важную роль в гемостазе и целостности фоторецепторов. Дисфункция клеток РПЭ является отличительной чертой различных заболеваний сетчатки, включая, помимо прочего, ВМД и ДР. Таким образом, исследования in vitro функции клеток РПЭ в норме и при заболеваниях имеют решающее значение для понимания молекулярных и клеточных механизмов некоторых сосудистых заболеваний сетчатки. С этой целью выделение первичных клеток РПЭ может стать важным инструментом для изучения основных механизмов и патогенеза различных глазных заболеваний, а также для предложения новых терапевтических применений для этих заболеваний. Этот метод позволяет изучать изменения в структуре и функции клеток РПЭ и их влияние на внешний BRB при ВМД и ДР. Кроме того, метод может быть применен для изучения изменений в клетках RPE, выделенных от мышей дикого типа C57BL6 и различных генетически модифицированных мышей, а также для тестирования различных фармакологических соединений в качестве терапевтических мишеней для ВМД-14.
В статье Elmasry et al. представлена экспериментальная модель ex vivo, которая может быть использована для изучения нейроваскулярных заболеваний сетчатки путем культивирования эксплантов сетчатки в течение длительного периода времени15. В этой системе ex vivo экспланты сетчатки представляют собой неповрежденные сосудистые и глиальные сети и нейроны сетчатки в течение 2 недель в культуре. Органотипические экспланты сетчатки стали надежным инструментом для изучения заболеваний сетчатки, таких как ДР и дегенеративные заболевания сетчатки16,17. По сравнению с другими существующими методами, использование эксплантов сетчатки поддерживает как культуры клеток сетчатки in vitro, так и животных моделей in vivo, добавляя уникальную особенность, которая позволяет исследовать перекрестные помехи между различными клетками сетчатки (например, сосудистыми, глиальными и нейрональными клетками) при одинаковых биохимических параметрах и независимо от системных переменных. Культуры эксплантов поддерживают различные клетки сетчатки вместе в одной и той же среде и сохраняют межклеточные физические и молекулярные взаимодействия. Более того, исследования показали, что экспланты сетчатки могут сохранять морфологическую структуру и функциональность культивируемых клеток сетчатки. Таким образом, экспланты сетчатки могут обеспечить подходящую платформу для исследования перекрестных помех между различными клетками сетчатки в ответ на биохимические изменения, такие как гипергликемия и гипоксия, аналогичные тем, которые наблюдаются при диабетической ретинопатии (ДР) или ретинопатии недоношенных (РН). Этот подход также позволяет тестировать терапевтические вмешательства в ограниченной биохимической среде. Культура эксплантов сетчатки представляет собой контролируемую технику и очень гибкую экспериментальную модель, которая позволяет проводить многочисленные фармакологические манипуляции и может раскрыть несколько молекулярных механизмов заболеваний сетчатки.