Method Article

Мониторинг пексофагии, опосредованной Stub1

DOI:

10.3791/65010

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол содержит инструкции по запуску и мониторингу Stub1-опосредованной пексофагии в живых клетках.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки млекопитающих могут переворачивать пероксисомы через Stub1-опосредованную пексофагию. Этот путь потенциально позволяет клеточному контролю количества и качества пероксисом. Во время этого процесса белок 70 теплового шока и убиквитин-лигаза E3, Stub1, перемещаются на пероксисомы, чтобы перевернуться, чтобы инициировать пексофагию. Активность лигазы Stub1 позволяет накапливать убиквитин и другие модули, связанные с аутофагией, на целевых пероксисомах. Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в пероксисомальном просвете может активировать пексофагию, опосредованную Stub1. Таким образом, можно использовать генерацию АФК с помощью красителя для запуска и мониторинга этого пути. В этой статье описываются процедуры использования двух классов красителей, флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров, для инициирования пексофагии в культурах клеток млекопитающих. Эти протоколы, основанные на генерации АФК с помощью красителей, могут не только использоваться для нацеливания на все пероксисомы в популяции клеток во всем мире, но также могут позволять манипулировать отдельными пероксисомами в отдельных клетках. Мы также описываем, как можно отслеживать пексофагию, опосредованную Stub1, с помощью микроскопии живых клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пероксисомы представляют собой органеллы, связанные с одной мембраной, присутствующие в большинстве эукариотических клеток. Пероксисомы представляют собой метаболический компартмент, необходимый для осуществления бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот, катаболизма пуринов и синтеза эфирфосфолипидов и желчных кислот1. Ацетил-КоА, полученный из пероксисом, контролирует гомеостаз липидов, регулируя центральную передачу сигналов в метаболизме2. Поэтому неудивительно, что нарушенные пероксисомальные функции подразумеваются при различных заболеваниях, включая нейродегенеративные расстройства,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток, экспрессирующих diKillerRed или самомечеющиеся белки (SLP) в просвете пероксисом

  1. Высевают нужные клетки на чашки для клеточных культур со стеклянным дном. Для проведения эксперимента поместите 2 x 105 клеток SHSY5Y человека в 840 мкл питательной среды (DMEM/F-12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) или 6 x 104 клеток NIH3T3 мыши в 840 мкл питательной среды (DMEM с добавлением 10% бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) на культуральную чашку диаметром 35 мм со стеклянной микролункой диаметром 20 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных ячеек должн....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Показанная здесь схема индукции пексофагии, опосредованная Stub1, использует преимущества генерации АФК с помощью красителя в просвете пероксисом. Эта операция требует минимальной интенсивности света. Таким образом, пероксисомы, содержащие флуоресцентные белки или красители, могут быть освещены с помощью стандартных конфокальных микроскопов с лазерным сканированием. Фокальное освещение приводит к мгновенному и локализованному образованию АФК в отдельных пероксисомах, на что указывает флуоресцентный репортер roGFP2-VKSKL .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описано, как запустить Stub1-опосредованную пексофагию в клеточных культурах путем повышения уровня пероксисомальных АФК с помощью света. Поскольку протокол основан на генерации АФК с помощью красителя, необходимо обеспечить достаточную экспрессию окрашивания лиганда diKillerRed-VKSKL или меченного красителем лиганда SLP в интересующих клетках. Учитывая, что разные типы клеток или клетки с разным генетическим фоном могут содержать пероксисомы с немного разными свойствами, может потребоваться нас.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана исследовательским грантом MOST 111-2311-B-001-019-MY3 от Национального совета по науке и технологиям Тайваня.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Чашка для культуры 35 мм со стеклянной микролункой диаметром 20 мм;MatTekP35G-1.5-20-C20 мм стеклянный дно
3-амино-1,2,4-триазол (3-AT)Sigma AldrichA8056
бычья сывороткаThermoFisher Scientific16170060
Инкубатор клеточных культурNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicaизготовлен путем добавления тандемного димера KillerRed с PTS1(VKSKL)
Модифицированная среда Dulbecco Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Модифицированная смесь Eagle Medium/питательных веществ F-12 от Dulbecco (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1 ClontechpEGFP-C1Основа EGFP-C1 была использована для клонирования EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaПЦР гена Hsp70 (HSPA1A) амплифицирован из кДНК HeLa и клонирован в EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicaполучен путем вставки человеческого гена SQSTM1 (путем ПЦР-амплификации кДНК клетки HeLa) в EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicaполучен путем вставки мышиного гена Stub1 (путем ПЦР-амплификации общей кДНК почки мыши) в EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
фетальная бычья сывороткаThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 добавлен и клонирован в магистраль EGFP-C1
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 нм Ex, 488 нм Ex, 561 нм Ex,  микроскоп с камерным инкубатором TOKAI HIT и насадкой для чашки UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 Вт, 555-570 нм
липофектамин 2000 ThermoFisher Scientific11668реагент для трансфекции
NIH3T3 клеткаATCCCRL-1658адгезивная
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850сниженная сывороточная среда
пенициллин/стрептомицинThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 ПЦР амплифицирована из кДНК HeLa и клонирована intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicaполученный путем добавления eroGFP (взятого из плазмиды Addgene 20131) с аминокислотной последовательностью VKSKL, и клонированный в EGFP-C1
SHSY5Y клеткаATCCCRL-2266адгезив
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

Related Articles