$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Животные представляют собой очень сложные системы, состоящие из сотен различных типов клеток, организованных в десятки различных тканей и органов. Изучение того, как группы клеток взаимодействуют друг с другом и окружающей средой во время эмбрионального развития, не только дает нам лучшее понимание того, как устроены взрослые организмы, но также может выявить молекулярные и клеточные основы болезней и врожденных дефектов. Некоторые модельные системы лучше других подходят для решения конкретных биологических вопросов, и ученые используют широкий спектр видов и экспериментальных методов, чтобы исследовать все разнообразие биологии организмов. Например, данный эксперимент по биологии развития может включать в себя генную инженерию, вскрытие животных, молекулярную биологию, биохимию и микроскопию с высоким разрешением. Такие методы может быть сложно воспроизвести только на основе письменных описаний и рисунков, поэтому важно документировать их в видеоформе, чтобы способствовать распространению надлежащей техники и методов анализа.
Взаимосвязь между механизмами развития и регенерацией, особенно в нервной системе, является областью пристального интереса, и рыбка данио, Danio rerio, стала ключевой моделью в этой области благодаря своему пожизненному росту и регенеративным способностям. Примечательно, что существует сложное взаимодействие между клетками сетчатки и зрительного тектума, и это взаимодействие необходимо для установления правильных связей по мере добавления новых нейронов в глазаи мозг. Хаген и др. описывают технику для характеристики того, как на рост и развитие нейронов влияет денервация после удаления глаза у живых эмбрионов рыбок данио-рерио2. В них подробно описывается, как 1) провести операцию по удалению глаза, 2) культивировать личинки после операции, 3) зафиксировать, препарировать и сохранить образцы мозга, 4) выполнить иммунофлуоресценцию и 5) правильно установить и визуализировать образцы. Этот метод может быть использован для изучения широкого спектра процессов развития нервной системы в неподвижных тканях, а также может быть модифицирован для экспериментов на живых эмбрионах.
Клетки нервного гребня (НКК) представляют собой важную линию развития, которая дает начало пигментным клеткам, хрящам, костям, гладким мышцам, нейронам и глии, и эти клетки участвуют во многих типах врожденныхдефектов. В дополнение к своей впечатляющей плюрипотентности, НКК также претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход с последующей обширной миграцией во время развития, что делает их увлекательной парадигмой для понимания взаимодействия между клеточной судьбой иморфологией. Куриные эмбрионы являются мощной системой для изучения биологии NCC, потому что NCC могут быть визуализированы in vivo и культивированы ex vivo, что позволяет проводить многие типы молекулярной обработки, которые трудно проводить с другими системами. Jacques-Fricke et al. описывают гибкий метод культивирования нейронных складок черепа для получения первичных культур NCC на покровных стеклах, покрытых фибронектином, за которым затем могут последоватьэксперименты с фиксированной визуализацией или визуализацией в реальном времени. Они описывают, как: 1) инкубировать и изолировать эмбрионы, 2) препарировать и покрывать нервные складки, 3) фиксировать и окрашивать NCC, а также 4) количественно оценивать и анализировать морфологию NCC.
Базальная мембрана — внеклеточный матрикс, образующийся вдоль базальной поверхности эпителиальных клеток — имеет решающее значение для установления морфологии тканей и функции органову животных. Фолликулярный эпителий дрозофилы , который окружает формирующуюся яйцеклетку, является отличной моделью для изучения того, как формируются базальные мембраны, поскольку он секретирует все основные консервативные компоненты базальноймембраны7, а матрикс ориентирован «наружу» яйцевой камеры, что облегчает анализы на основе микроскопии. Шах и Девернь описывают использование одного из самых популярных видов микроскопии сверхвысокого разрешения — Airyscan, — для изучения того, как везикулярный транспорт влияетна формирование базальной мембраны. Они показывают, как 1) собирать и фиксировать яичники дрозофилы , 2) проводить иммунофлуоресценцию, 3) правильно монтировать образцы и 4) захватывать высококачественные наборы данных сверхвысокого разрешения для трехмерного анализа. Отметим, что эта статья включает в себя чрезвычайно полезное и краткое руководство по правильному получению ненасыщенных трехмерных конфокальных наборов данных, которое должно представлять общий интерес для всех, кто хочет количественно оценить флуоресцентные изображения.
В то время как технологии сверхвысокого разрешения на основе микроскопов (например, STED, SIM и Airyscan)10 становятся все более распространенными, они дороже стандартных конфокальных микроскопов и доступны не всем исследователям. Альтернативным методом получения изображений со сверхвысоким разрешением является экспансионная микроскопия (ExM), которая включает в себя физическое увеличение биологического образца в трех измерениях путем встраивания и связывания его с набухающим гидрогелем11. Расширенные образцы затем могут быть визуализированы с помощью стандартного конфокального микроскопа для получения изображений с боковым разрешением порядка десятков нанометров, конкурирующих с другими типамимикроскопии со сверхвысоким разрешением. Наша группа описывает, как реализовать ExM на эмбрионах дрозофилы целиком, чтобы выявить субклеточные особенности цитоскелета актомиозина и митохондриальных сетей, которые не могут быть обнаружены с помощью стандартной конфокальноймикроскопии. Мы описываем, как 1) правильно отбирать эмбрионы на стадии, 2) проводить иммунофлуоресценцию, 3) подготавливать и монтировать эмбрионы к экспансии, 3) переваривать и расширять эмбрионы и 4) собирать наборы данных со сверхвысоким разрешением. Этот метод должен быть модифицируемым для широкого спектра биологических образцов порядка 1 мм, что делает его доступным для широкого круга биологических лабораторий.
Биология развития по необходимости является в высшей степени изобретательной и междисциплинарной областью, которая опирается на методы из различных научных областей для количественной оценки клеточной биологии в том виде, в каком она происходит у животных. В этой статье мы выделяем четыре метода биологии развития у рыбок данио, цыплят и плодовой мухи, которые включают в себя как классические, так и передовые методы исследования морфологии клеток и локализации субклеточных белков во время развития животных. В настоящее время эта область сосредоточена на объединении количественного анализа морфологии и поведения клеток с транскриптомными и протеомными экспериментами для выявления всего разнообразия молекул и биомеханических сил, которые контролируют развитие животных.