$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Протеомные подходы могут включать в себя обнаружение и количественное определение пептидов, белков и специфических посттрансляционных модификаций (ПТМ), присутствующих в определенном клеточном состоянии, а также белков, объединяющихся в определенные органеллы или макромолекулярные белковые комплексы. Протеомика — это разнообразная область, которую можно разделить на общие и количественные рабочие процессы. Количественная протеомика сосредоточена на определении количества белка или белка PTM в образце. Биологический вопрос должен быть рассмотрен до проведения любого эксперимента по протеомике, чтобы определить наиболее подходящий метод подготовки образца, секвенирования и анализа данных, необходимых для ответа на этот вопрос. Белки обладают высокой динамикой, а масс-спектрометры чувствительны к секвенированию белков с более высоким содержанием по сравнению с менее распространенными ПТМ; Поэтому выбор рабочих процессов пробоподготовки и секвенирования имеет решающее значение. В этом сборнике методов описываются подходы к количественному определению определенных типов белков с использованием передовых методов МС и приводится рабочий процесс анализа данных для белковых сетей.
Пептидомика — это изучение пептидов, естественным образом образующихся во время нормальных клеточных процессов, а также в условиях болезни, и этот подход исторически был ограничен количественным определением на основе антител до тех пор, пока процессы жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией и экстракцией пептидов не достигли их текущего состояния. Эти достижения, наряду с применением тепловой инактивации эндогенных протеаз, теперь позволяют идентифицировать и количественно оценить сотни внутриклеточных пептидов. В работе Correa et al.2 авторы описывают процесс подготовки образцов, который включает в себя тепловую инактивацию, экстракцию пептидов в мягких условиях для сохранения пептидных связей и относительное количественное определение с помощью мечения стабильными изотопами аминов. Авторы разработали недорогой подход, который может позволить идентифицировать и количественно оценить нативные и биологически активные пептиды из клеточных культур и образцов тканей. Этот подход может быть использован для обнаружения специфических для заболевания пептидных биомаркеров, антимикробных пептидов или мишеней для будущих терапевтических разработок.
Достижения в области масс-спектрометрии и биоинформатики в настоящее время позволяют детально характеризовать протеомы из различных источников биологического материала3. Расшифровка биологического значения протеомных паттернов экспрессии в этих сложных образцах остается серьезной проблемой в полевых условиях. Чтобы решить эту проблему, Вандервалл и др. представляют JUMPn, программу системной биологии и связанный с ней рабочий процесс, который организует протеомные данные в модули (т.е. белковые комплексы), которые соединяют кластеры коэкспрессии белков с соответствующимиузлами сети белок-белковых взаимодействий (PPI). Авторы оценивают эффективность этого инструмента с использованием существующих протеомных наборов данных, а также смоделированных данных и показывают его полезность для облегчения биологической интерпретации сложных протеомных наборов данных. Их результаты показывают, что этот подход может быть использован для измерения активации транскрипционного фактора и каскада киназ, демонстрируя его полезность для выявления движущих сил заболеваний человека, а также для других исследований, пытающихся определить биологические механизмы на основе глубоких данных протеома.
Инозитолпирофосфаты (PP-InsP) обнаружены во всех эукариотических клетках, где они функционируют как метаболические сигнальные молекулы и регулируют различные процессы5. Исторически сложилось так, что из-за физических свойств и низкой концентрации PP-InsP анализ был ограничен использованием радиоактивных индикаторов, которые стоят дорого и требуют особого ухода и хранения. В качестве альтернативы Qiu et al. разработали протокол, позволяющий проводить высокопроизводительное абсолютное количественное определение инозитолпирофосфатов из клеточной культуры или исходного материала тканей с помощью масс-спектрометрии с электроспреем с помощью капиллярного электрофореза (CE-ESI-MS)6. В своем отчете они показывают, как этот подход может быть использован для профилирования всех PP-InsP, присутствующих в образце, разрешения видов и идентификации региоизомеров с целью выявления пространственных и временных изменений при различных условиях и состояниях заболевания.
Большая часть клеточных процессов контролируется фосфорилированием белков, и ошибки в этих сигнальных путях связаны со многимиразличными болезненными состояниями. Тем не менее, все еще существуют значительные пробелы в понимании полных механизмов регуляции протеинфосфатаз и киназ в различных типах клеток и при различных условиях. Чтобы устранить эти пробелы в понимании, Smolen et al. представляют новый рабочий процесс с использованием гранул ингибитора фосфатазы в сочетании с масс-спектрометрией (PIB-MS)8. Используя неселективный ингибитор фосфопротеинфосфатазы, микроцистин-LR, связанные с тозефарозными шариками, авторы способны обогащать эти целевые белки. Кроме того, используя мягкие условия промывки для удаления неспецифических содержательных элементов, они также смогли захватить белковые интеракторы. Они показывают, как этот подход может быть использован для идентификации и количественной оценки фосфопротеинфосфатаз, их статуса фосфорилирования и потенциальных белок-белковых взаимодействий как в клеточной культуре, так и в тканях.
Достижения в методах пробоподготовки, таких как стратегии количественного определения эндогенных пептидов, обогащения фосфатазами и киназами, белковых взаимодействий и инозитолпирофосфатов, расширяют базу знаний о динамике белков в биологических процессах. Развитие масс-спектрометров, таких как независимый сбор данных, в отличие от сбора, зависящего от данных, позволяет увеличить глубину секвенирования для идентификации пептидов таким образом, что пептиды с более высоким содержанием не маскируют пептиды с более низким содержанием во время сбора данных, что позволяет идентифицировать другие классы белков. Масс-спектрометры timsTOF помогут продвинуть будущее вперед, включив подвижность ионов в дополнение к жидкостной хроматографии в качестве дополнительного разделения пептидов, что обеспечит еще более глубокое секвенирование и повысит вероятность обнаружения пептидов из стратегий подготовки образцов, описанных в этой коллекции. Область протеомики будет продолжать развиваться на основе новых методологий подготовки образцов, достижений в области масс-спектрометров для сбора данных и инструментов биоинформатического анализа, таких как JUMPn, для понимания биологических сложностей и функций.