Методическая статья

Бесклеточные экспрессионные системы: методы производства и использования

393 просмотров

⸱

28 июля 2023 г.

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

В этой статье

Аннотация

ОБСУЖДАЕМЫЕ СТАТЬИ:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE бесклеточная система. Журнал визуализированных экспериментов. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. От клеток к синтезу бесклеточного белка в течение 24 часов с использованием бесклеточного процесса автоиндукции. Журнал визуализированных экспериментов. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Быстрое, доступное и несложное производство бактериального безклеточного лизата. Журнал визуализированных экспериментов. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, ферментативные методы для амплификации минимальных, линейных шаблонов для прототипирования белков с использованием бесклеточных систем. Журнал визуализированных экспериментов. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Быстрая характеристика генетических частей с помощью бесклеточных систем. Журнал визуализированных экспериментов. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Высокопроизводительный инструментарий транскрипции-трансляции streptomyces для применения в синтетической биологии и натуральных продуктах. Журнал визуализированных экспериментов. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Жидкостная хроматография в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим детектированием для профилирования метаболитов в бесклеточных системах на основе лизата. Журнал визуализированных экспериментов. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Получение многофункциональных микрокапсул на основе шелка, загруженных плазмидами ДНК, кодирующими РНК-аптамеры и рибопереключатели. Журнал визуализированных экспериментов. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Исследование от проектирования до реализации для разработки и валидации пациентами диагностики переключателя на бумажном носителе. Журнал визуализированных экспериментов. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Редакционная статья

Системы бесклеточной экспрессии (CFE) представляют собой набор инструментов, которые воссоздают ключевые клеточные процессы транскрипции, трансляции и метаболизма за пределами клетки1. Такие методы быстро набирают популярность, предлагая упрощенные эксперименты за счет удаления клеточных мембран и снижая сложность за счет удаления геномной ДНК и соответствующей сложности взаимодействий между генетической конструкцией и хозяином. В настоящее время системы CFE используются для фундаментальных исследований, сенсоризации, биопроизводства и образования. В этой коллекции методов представлены девять примеров новых способов создания и использования бесклеточных систем.

Три метода направлены на то, чтобы сделать производство бесклеточных систем более доступным. Grasemann et al. описывают более простой способ создания системы PURE, системы CFE, которая восстанавливает все компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, вместо использования клеточных лизатов2. Вместо того, чтобы экспрессировать и очищать каждый из 36 белковых компонентов, авторы объединяют экспрессирующие штаммы, предлагая производство функциональной системы PURE в течение недели. Smith et al. предлагают упрощенный процесс производства систем CFE на основе лизата с использованием оптимизированного подхода к культивированию, который сокращает общий рабочий процесс до 24 часов, что может быть достигнуто в обычные рабочие часы3. Cooper et al. описывают метод с использованием модифицированного штамма E. coli , который обеспечивает лизис клеток путем замораживания-оттаивания, устраняя необходимость в специализированном оборудовании, требуемом другими методами4. Все эти методы вносят свой вклад в тенденцию усилий, направленных на то, чтобы сделать производство бесклеточных систем достижимым для лабораторий с меньшей инфраструктурой и опытом работы со сложными традиционными протоколами. С появлением конкурирующих коммерческих комплектов все больше и больше лабораторий могут исследовать преимущества систем CFE с минимальным риском. С помощью методов, подобных представленным здесь, эти лаборатории могут затем выбрать создание собственных систем CFE, адаптированных к их потребностям, без огромных вложений в оборудование или время.

Два метода сосредоточены на преимуществах быстрого и высокопроизводительного экспериментирования, возможного с системами CFE. Dopp et al. представляют метод амплификации линейных матриц ДНК для быстрого скрининга генетических конструкций5. Используя их подход, генетические дизайны могут быть заказаны у компаний, занимающихся синтезом ДНК, а затем амплифицированы и проверены в течение 24 часов. McManus et al. описывают аналогичный подход, при котором репортерный ген амплифицируется различными праймерами, кодирующими различные регуляторные компоненты6. Низкая стоимость олигонукосов в сочетании с системами CFE позволяет быстро и экономически эффективно проводить скрининг компонентов, таких как промоторы. Оба метода подчеркивают потенциал систем CFE для быстрого экспериментирования, сокращая сроки проектирования и тестирования конструкции с недель при использовании традиционного клонирования до дней или даже часов.

Следующие три метода предоставляют инструменты для специализированного использования систем CFE. Toh et al. предлагают метод создания систем CFE из Streptomyces venezuelae7. Большинство протоколов CFE основаны на E. coli, включая все другие методы в этой коллекции. Этот новый метод для S. venezuelae привносит преимущества систем CFE в организм, представляющий широкий интерес для производства натуральных продуктов. Dinglasan et al. предлагают способ измерения концентраций метаболитов во внеклеточных реакциях8. Такие измерения имеют решающее значение для применения в бесклеточной метаболической инженерии, где интактный метаболизм систем CFE используется для производства небелковых продуктов, представляющих интерес. В-третьих, Drachuk et al. представляют микрокапсуляцию ДНК для добавления к реакциям CFE9. Этот подход является репрезентативным для набора методов, которые позволяют рационально повторно внедрить преимущества компартментализации в системы CFE после удаления естественных мембран в процессе производства систем CFE. Каждый из этих методов диверсифицирует спектр применений, для которых могут быть применены системы CFE.

Наконец, Jaenes et al. описывают методы создания реальной диагностики вируса Зика на основе систем CFE10. Тесты и инструменты имеют низкую стоимость по сравнению с конкурирующими технологиями, такими как ПЦР, и авторы успешно протестировали свою диагностику с использованием образцов пациентов в нескольких странах. Эта работа является ярким примером применения зондирования в точках необходимости, что, возможно, является областью, в которой системы CFE готовы оказать самое непосредственное влияние на реальный мир.

В совокупности эти методы охватывают репрезентативную полосу основных областей активных исследований в области систем CFE в последние годы. Методы, которые улучшают производство систем CFE и позволяют проводить эксперименты с высокой производительностью, хорошо представлены, а также присутствуют примеры многочисленных более специфических применений систем CFE. Другие области интересов включают производство сложных белков для медицинского применения, включение неканонических аминокислот, оптимизацию для долгосрочного хранения и разработку искусственных клеток. Мы ожидаем, что внедрение систем CFE будет продолжать ускоряться, учитывая сниженный барьер для входа, потенциал для быстрого экспериментирования и более широкий спектр возможностей, и все это стало возможным благодаря методам, представленным в этой коллекции. Остальные проблемы зависят от области применения. Для биопроизводства решающее значение будет иметь масштабное снижение затрат за счет перехода на более дешевые субстраты и улучшенной переработки. Для зондирования необходима значительная работа на примере Jaenes et al., чтобы продемонстрировать надежную производительность в различных приложениях в точках необходимости. В целом, в этой области необходимо продолжать совершенствовать основные методы, расширяя при этом репертуар того, что можно сделать с помощью систем CFE.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность Офису министра обороны за программу прикладных исследований для продвижения приоритетов науки и техники за поддержку сотрудничества, которое привело к созданию этой коллекции.

Ссылки

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

Похожие статьи