$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает примерно 1 из 400 человек в течение жизни. Заболевание первоначально проявляется в виде поражения верхних и нижних двигательных нейронов и в конечном итоге прогрессирует до паралича и смерти в результате дыхательной недостаточности в течение 2–5 лет после появления симптомов1. БАС может быть наследственным, с более чем 30 различными генетическими мутациями, но только 4 варианта гена (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) составляют около 55% семейных случаев БАС. Большинство случаев БАС, примерно 90%, представляют собой спорадический БАС, основные причины которого до сих пор до конца не изучены2. Существует острая необходимость в раскрытии механизмов БАС с помощью соответствующих инструментов и модельных организмов. В этой коллекции методов мы представляем обзор последних исследований с точки зрения имитации этого заболевания и, как мы надеемся, в конечном итоге поиска вариантов лечения. Например, применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые могут быть дифференцированы в моторные нейроны или астроциты, предлагает гуманизированную модельную систему 3,4,5. Кроме того, в этой коллекции методов представлены животные модели, такие как дрозофила для изучения поглощения глюкозы и нервно-мышечного соединения (NMJ) in vivo 6,7, мыши для изучения корковых нейронов8 и C. elegans или рыбки данио для исследования двигательных нарушений 9,10 и посмертных тканей пациента11.
Личинки данио-рерио прозрачны, а их моторные нейроны видны напрямую, что делает их идеальным инструментом для неинвазивных исследований in vivo . Asakawa et al. показывают фазовый переход оптогенетически экспрессируемого TDP-43 в одиночных спинальных мотонейронах9. После облучения можно наблюдать и анализировать цитоплазматическую релокацию TDP-43. Агрегация цитоплазматического TDP-43 является отличительной чертой дегенеративных моторных нейронов при БАС. Этот метод позволяет проводить функциональное изучение и анализ БАС-ассоциированных белков субклеточным, временным способом.
Используя микроскопию структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением, Койн и Ротштейн подробно описывают протокол, который изолирует ядра и описывает, как исследовать нуклеопориновыекомплексы. Нуклеопориновые комплексы состоят из множественных копий около 30 различных нуклеопориновых белков (Nups). Было показано, что нарушение нуклеоцитоплазматического транспорта (NCT) и изменения Nup являются ранними признаками многих нейродегенеративных заболеваний, включая БАС. Извлекая ядра, можно исследовать отдельные белки Nup внутри NPC и нуклеоплазмы в 3D. Интересно, что это может быть применено не только к клеткам, полученным от иПСК, но и к посмертным тканям.
Currey и Liachko описывают два анализа для различения легких, умеренных и тяжелых двигательных нарушений в моделях C. elegans с БАС10. При анализе радиальной локомоции измеряется ползание по поверхности, что делает этот анализ простым и экономичным. Во втором методе, анализе плавания, толчковые движения могут быть измерены с помощью компьютерного метода слежения. Авторы используют это для изучения TDP-43 и тау.
Хейс и др. также описывают метод изучения NCT8. Они применяют метод пермеабилизации к культурам нейронов. Используя первичные нейроны коры головного мозга мыши, они описывают метод, который поддерживает целостность ядерной мембраны с использованием гипотонического лизиса в сочетании с подушкой из бычьего сывороточного альбумина. Таким образом, импорт ядерных материалов по-прежнему функционирует энергозависимым образом, обеспечивая тем самым платформу для микроскопии и анализа с высоким содержанием углерода. В будущем эта платформа будет иметь широкое применение для изучения пассивного и активного переноса ядра в первичных нейронах.
Быстрая оценка того, как манипуляции, связанные с заболеванием белки или РНК влияют на синаптические процессы и могут ли терапевтические препараты восстановить эти функции, имеет важное значение для исследований БАС. Используя моторные нейроны, полученные из iPSC, а также первичные нейроны мышей, Krishnamurthy et al. представили протокол, который позволяет в режиме реального времени отслеживать динамику притока пресинаптического кальция и слияние мембран синаптических везикул3. Авторы демонстрируют, что трансфекция C9orf72-(GA)50 ухудшает синаптическую передачу, подчеркивая пригодность этих методов для обнаружения различий в синаптической функции, основанных на мутациях.
Измененное поглощение глюкозы является одной из патобиологических характеристик БАС. В этой модели дрозофилы Логанатан и др. описывают основанный на FRET метод измерения внутриклеточных изменений в поглощении глюкозы в конкретных клетках6. Используя генетически кодируемый FRET датчик глюкозы, они проверяют свой метод с помощью экспрессионных нейронов TDP-43, которые демонстрируют более высокое поглощение глюкозы. В мутантной линии TDP-43G298S повышенное поглощение глюкозы обнаруживается только при стимуляции глюкозой. Этот метод является важным инструментом для изучения гликолиза не только при БАС, но и в целом в отношении регенерации двигательных нейронов.
Методы препарирования, сохраняющие архитектуру NMJ, имеют первостепенное значение для изучения изменений в двигательных нейронах вдоль ноги дрозофилы с течением времени. Стилвелл и Агудело используют метод, который позволяет охарактеризовать NMJ для идентификации арборов моторных нейронов с помощью иммуноцитохимии7. Интересно, что взрослые нейроны присутствуют на протяжении всей жизни мухи, которая составляет примерно 90 дней. Сравнивая мутацию SOD1H71Y с мутацией дикого типа, авторы демонстрируют различные маркеры возрастного отека бутонов, белковых агрегатов и увеличенных митохондрий.
Инновация в области имитации NMJ с использованием системы совместного культивирования отвечает насущной потребности в изучении диссоциации между моторными нейронами и миотрубками. С точки зрения этого метода, Stoklund Dittlau et al. описывают, как культивировать моторные нейроны человека, полученные из iPSC, и микротрубки, полученные из первичного мезоангиобласта человека, для формирования функционально активных NMJ4. Авторы демонстрируют их функциональность путем активации моторных нейронов с притоком хлорида калия и кальция в миотрубках, меченных Fluo-4, которая впоследствии была отменена введением блокаторов NMJ.
В последнее время все большее внимание уделяется системам сокультур. Изучение не только одного, но и нескольких типов клеток в чашке имеет то преимущество, что позволяет лучше имитировать физиологические условия, чем методы с использованием монокультурных клеток. С помощью этого подхода можно изучать патобиологию, связанную с БАС, такую как опосредованная астроцитами токсичность и гипервозбудимость нейронов. В видео, снятом Taga et al., показана генерация корковых нейронов и астроцитов в кокультуре в сочетании с многоэлектродной матрицей (MEA) для мониторинга электрофизиологии5. Функциональная активность может контролироваться с течением времени, что обеспечивает гибкость клеточного состава, а также различных условий культивирования. Это дополнительно обеспечивает платформу для проверки терапевтического потенциала лекарственных препаратов и их влияния на функциональную активность.
В настоящее время существует только три одобренных FDA метода лечения БАС, и все они имеют ограниченный потенциал применения. Чтобы найти более перспективные методы лечения, будущие исследования должны лучше понять патобиологию, используя несколько модельных систем и подходов. Без сомнения, человеческие модели, полученные с помощью iPSC, обеспечат интересную платформу для исследования лежащих в основе молекулярных механизмов. Это, в сочетании с модельными системами, такими как данио-рерио, C. elegans, дрозофила или грызуны, приведет к прогрессу в этой области. Кроме того, будущие эпидемиологические исследования, как мы надеемся, дадут больше информации о том, какую роль играют факторы окружающей среды в развитииБАС-12. С расширением наборов данных и развитием биоинформатики с высокой скоростью, в будущем станет легче разгадать общие знаменатели нейродегенеративных заболеваний. Это приведет к новым возможностям для терапии или даже профилактики.