$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Еще до того, как в 2017 году была присуждена Нобелевская премия за криоэлектронную микроскопию (криоЭМ) биологических молекул, эта область вызвала ажиотаж. Революция в разрешении проблем шла полным ходом, и структурная биология рассматривала криоЭМ в качестве метода определения характеристик, приближающегося к золотому стандарту рентгеновской кристаллографии. На раннем этапе область криоЭМ в основном охватывала данные, полученные с помощью криопросвечивающих электронных микроскопов (криоПЭМ). Теперь, по мере развития микроскопов, приборов для пробоподготовки и методов пробоподготовки, типы получаемых данных стали более разнообразными. CryoEM больше не зарезервирован для определения характеристик белков с помощью cryoTEM. Эта область расширилась и теперь включает данные, полученные с помощью криосканирующих электронных микроскопов и сфокусированного ионного пучка (cryoSEM/FIB). Влияние ощущается в более широком смысле во многих дисциплинах, включая исследования молекул, клеток, тканей и синтетических материалов, таких как гидрогели.
Достижения в области визуализации стали движущей силой в развитии криоЭМ. Усовершенствования в камерах, детекторах и обработке изображений проложили путь к получению изображений с меньшими затратами энергии, что позволяет хрупким биологическим образцам выжить в процессе визуализации. В ПЭМ воздействие низкой дозы пучка привело к применению томографии, при которой один образец многократно визуализируется под разными углами для создания 3D-реконструкции 2,3. Достижения в области SEM/FIB также привели к улучшению разрешения при меньшем потреблении энергии. Важно отметить, что это привело к улучшению визуализации непроводящих образцов, что приводит к лучшей объемной визуализации в SEM/FIB 4,5. Эти усовершенствования улучшили все виды биологической электронной микроскопии, но особенно они улучшили криовизуализацию, в которой образцы являются хрупкими и не содержат дополнительных тяжелых металлов для улучшения контраста.
По мере развития возможностей визуализации развивались и приборы для подготовки образцов. При подготовке образцов с помощью криоЭМ первым шагом является успешная витрификация образцов. Гидратированные образцы замораживаются с образованием аморфного льда, что позволяет избежать повреждений, вызванных образованием кристаллов льда. Ведущими стратегиями являются врезная заморозка в жидком этане для молекул и малых клеток или заморозка под высоким давлением (HPF) для более крупных образцов толщиной до нескольких сотен микрон. Достижения в области технологии плунжерной заморозки позволяют лучше захватывать молекулы во всех направлениях за счет уменьшения самосборки вдоль границы раздела воздух/вода6. Кроме того, достижения в области технологии HPF позволяют проводить световую и электрическую стимуляцию образцов за несколько мгновений до замораживания7. Совсем недавно была разработана новая технология HPF, которая может взаимодействовать с флуоресцентным микроскопом, обеспечивая короткую временную задержку (<2 с) между флуоресцентной визуализацией живых клетоки замораживанием HPF.
Вышеупомянутые достижения дали толчок развитию криоЭМ и вдохновили на разработку новых методов. Кроме того, произошло оживление устоявшихся методов. Здесь мы представляем коллекцию методов, ориентированных на продвижение криоЭМ с целью распространения этих стратегий в быстро расширяющейся области исследований.
В то время как усовершенствование возможностей визуализации и инструментов для подготовки образцов было основной движущей силой прогресса в области криоЭМ, основным препятствием в этом исследовании по-прежнему остается практическая подготовка образцов. Truong et al.9 представляют метод, который использует преимущества формирования монослоя липидов на границе раздела воздух/вода. Липидный слой образуется на сетке ПЭМ и выступает в качестве каркаса для мембранных белков, представляющих интерес. Для образцов с многослойной или многослойной мембраной Johnson et al.10 представляют стратегию «отслаивания» лишних слоев, оставляя на сетке один слой, подходящий для визуализации ПЭМ. В другой статье Chang et al.11 признают, что некоторые белки зависят от температуры и что соответствующая структура наблюдается при повышенных температурах. Они описывают модифицированный метод погружной заморозки, который позволяет наносить образцы на сетку при повышенных температурах, сохраняя при этом стекловидный лед после погружной заморозки. Для дальнейшего управления процессом подготовки криогенных сеток Kang et al.12 представляют высокопроизводительный метод производства микроструктурированных чипов для TEM-сеток, в которых поры имеют контролируемую глубину. Этот метод может предоставить еще одну переменную для контроля толщины аморфного льда во время подготовки сетки.
Корреляция нескольких методов визуализации имеет большое значение. Бибер и др.13 описывают криорабочий процесс, в котором замороженная сетка визуализируется в криофлуоресцентном микроскопе для определения местоположения флуоресцентной области, представляющей интерес. Затем сетка переносится в криоSEM/FIB, где используются реперные точки для выравнивания флуоресцентного изображения с изображением SEM, что позволяет использовать флуоресцентную область для фрезерования FIB. Целевой участок утончается до нескольких сотен нанометров, а затем сетка переносится в криоТЕМ для томографии на истонченном целевом месте. DiCecco et al.14 демонстрируют корреляцию между жидким TEM и cryoTEM, тем самым приближаясь к цели сопряжения данных криoTEM с высоким разрешением с данными TEM молекул в динамическом движении.
Автоматизированный сбор больших наборов данных также представляет интерес. Необходимо максимально использовать ценное время, затрачиваемое на работу прибора, и ключевым этапом является автоматизация. Kumar et al.15 описывают пошаговую настройку программного обеспечения для автоматического сбора данных для визуализации cryoTEM.
По мере того, как область криоЭМ продолжает развиваться, будут наблюдаться дальнейшие успехи в подготовке образцов, и влияние криоЭМ будет ощущаться в широких масштабах во всех других дисциплинах. Некоторые достижения будут связаны не с новыми методами, а с усилением уже существующих. Эти методы будут быстрее, проще и надежнее, а производительность выше. По мере того как автоматизация увеличивает объем выводимых данных, ключевыми областями развития будут анализ изображений и обработка данных. Кроме того, важную роль будет играть искусственный интеллект. Следует ожидать снижения затрат на контрольно-измерительные приборы и занимаемой площади, что позволит этой технологии стать более доступной, хотя эти разработки могут реализовываться медленнее.