$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Гликоген, разветвленный полимер глюкозы, играет важную роль в энергетическом обмене у прокариот и эукариот. В условиях ограничения питательных веществ бактерии и дрожжи используют гликоген для выживания клеток1. У млекопитающих гликоген играет тканеспецифическую роль, в том числе местное использование в мышцах для стимулирования сокращения и в печени для регулирования уровня глюкозы в крови2. Синтез гликогена катализируется гликогенсинтазой, которая соединяет остатки глюкозы через альфа-1,4-связи, и ветвящимся ферментом, который образует альфа-1,6-связи, создавая таким образом ответвления в макромолекуле гликогена. Утилизация этого запаса энергии облегчается гликогенфосфорилазой в сочетании с ферментом, разрушающим ветвление, что приводит к ремоделированию гликогена и высвобождению глюкозы-1-P. Структура гликогена, включая размер частиц и ветвление, представляет интерес отчасти потому, что разветвление влияет на растворимость гликогена, размер частиц гликогена влияет на скорость их разложения, а структурная нестабильность гликогена связана с диабетом. Кроме того, исследование субклеточной локализации гликогена важно в тканях, таких как мышцы, чтобы получить информацию о роли этого топлива во время физических упражнений.
Накопление гликогена контролируется относительной активностью ферментов, синтезирующих гликоген, и ферментов, разрушающих макромолекулу. В Wilson3 описаны методы измерения ферментативной активности гликогенсинтазы, гликогенфосфорилазы, ветвящегося фермента и фермента дебранчинга. Эти биохимические методы измеряют производство или потребление NADH/NADPH или колориметрические изменения с помощью спектрофотометра. Это масштабируемые подходы, которые позволяют обойти высокую стоимость, специализированное оборудование и нормативное бремя, связанное с более чувствительным методом, в котором используются радиоизотопы. Описанные методы наиболее пригодны для измерения активности ферментов с помощью очищенных ферментов, хотя при достаточном разведении гомогената и надлежащем контроле они были использованы с образцами тканей. В Wilson3 также описан простой колориметрический анализ для измерения ветвления гликогена. Хотя этот метод дает меньше информации о тонкой структуре гликогена, чем более трудоемкие методы разделения, он обеспечивает простое и быстрое измерение относительных степеней разветвления.
Fermont et al.4 описывают использование флуорофор-ассистированного углеводного электрофореза (FACE), метода определения распределения длины цепи (CLD), которое является отражением размера частиц гликогена и процента ветвления. Структура гликогена влияет на способность бактерий выживать при голодании, а аномальный гликоген накапливается при нескольких заболеваниях при хранении гликогена, что подчеркивает важность методов изучения размера и разветвления этого источника топлива. FACE включает восстановительное аминирование гемиацетальной группы 8-амино1,3,6 пирентрисульфоновой кислотой (APTS). Помимо предоставления информации о CLD, FACE полезен для измерения каталитических свойств ветвящихся ферментов из различных источников. Основной конкурирующий метод, HPAEC-PAD, имеет преимущество в том, что не требует нередукционных концов, но этот метод имеет проблему массового смещения.
Степень разветвления и размер частиц гликогена являются важными характеристиками полимера глюкозы. С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что гликоген существует в трех структурах: сферических бета-частицах (~20 нм), которые включают несколько гамма-частиц (3 нм), и более крупных розетообразных альфа-частицах (~300 нм), состоящих из бета-частиц5. Традиционные методы выделения гликогена достаточны для измерения концентрации гликогена, но они нарушают тонкую структуру гликогена, что означает, что требуется разработка более мягкого метода. Экстракция холодной водой с использованием центрифугирования с градиентом плотности сахарозы описана для использования у бактерий в работах Wang, Wang et al.6. Этот метод превосходит другие методы в сохранении как более крупных молекул гликогена, измеренных с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), так и более длинных цепей, измеренных с помощью флуорофор-ассистированного капиллярного электрофореза (FACE)6. Wang, Liu et al.7 также применяют аналогичный метод к печени. Важность понимания структуры гликогена демонстрируется недавним отчетом, показывающим, что при диабете альфа-частицы гликогена печени являются «хрупкими», что приводит к более быстрой деградации по сравнению со стабильными альфа-частицами, что, возможно, влияет на контроль уровня глюкозы в крови. Ограничения этих методов выделения на основе градиента сахарозы включают потерю гликогена в надосадочной жидкости, которая может быть смягчена более низкой концентрацией сахарозы, и ферментативную деградацию части гликогена из-за используемых мягких условий. Последний смягчается кратковременной стадией кипячения, хотя это разрушает связанные с ним белки.
Наконец, Jensen et al.8 описывают использование просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для визуализации субклеточного распределения гликогена и размера частиц в отдельных скелетных мышечных волокнах. Этот метод является единственным доступным для исследования субсарколеммальных, интермиофибриллярных и интаммиофибриллярных пулов гликогена и был использован на мышечных тканях различных животных. Поскольку некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген в качестве топлива, важно охарактеризовать расположение этих топливных запасов. Кроме того, этот метод дает возможность исследовать метаболизм гликогена в отдельных типах мышечных волокон, что важно в физических упражнениях, где усталость зависит от гликогена только в отдельных волокнах. Одним из ограничений метода ПЭМ является невозможность обнаружения мелких частиц гликогена, и это особенно актуально для условий, при которых гликоген разрушается, например, во время сокращения мышц.
В заключение, данная коллекция методов представляет собой образец методов, которые используются для исследования структуры гликогена и ферментов, регулирующих анаболизм и катаболизм этой макромолекулы. Эти методы будут способствовать улучшению нашего понимания метаболизма гликогена как при физиологических, так и при патологических состояниях.