Method Article

Выделение внеклеточных везикул с низким содержанием эндотоксинов, полученных из линий раковых клеток

DOI:

10.3791/65062

⸱

February 17th, 2023

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предлагаемый протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать контаминации эндотоксином при выделении внеклеточных везикул из надосадочных продуктов клеточных культур и как правильно их оценивать.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную популяцию мембранных везикул, высвобождаемых клетками in vitro и in vivo. Их вездесущность и значительная роль в качестве носителей биологической информации делают их интригующими объектами исследования, требующими надежных и повторяющихся протоколов для их выделения. Однако реализовать весь их потенциал сложно, поскольку все еще существует множество технических препятствий, связанных с их исследованиями (например, правильное приобретение). В данном исследовании представлен протокол выделения малых ЭВ (по номенклатуре MISEV 2018) из супернатанта культуры линий опухолевых клеток на основе дифференциального центрифугирования. Протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время выделения электромобилей и как правильно их оценивать. Загрязнение электромобилей эндотоксинами может значительно затруднить последующие эксперименты или даже замаскировать их истинные биологические эффекты. С другой стороны, упущенное из виду присутствие эндотоксинов может привести к неправильным выводам. Это имеет особое значение, когда речь идет о клетках иммунной системы, включая моноциты, потому что моноциты составляют популяцию, которая особенно чувствительна к остаткам эндотоксина. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить скрининг EV на загрязнение эндотоксинами, особенно при работе с чувствительными к эндотоксину клетками, такими как моноциты, макрофаги, клетки-супрессоры миелоидного происхождения или дендритные клетки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ), согласно номенклатуре MISEV 2018, являются собирательным термином, описывающим различные подтипы секретируемых клетками мембранных везикул, которые играют решающую роль в многочисленных физиологических и патологических процессах 1,2. Кроме того, электромобили обещают стать новыми биомаркерами различных заболеваний, а также терапевтическими агентами и средствами доставки лекарств. Однако реализовать весь их потенциал сложно, так как все еще существует множество технических препятствий, связанных с их приобретением3. Одной из таких проблем является выделение электромобилей, не содержащих эндотоксинов, которым во многих случаях пренебрегают. Одним из наиболее распространенных эндотоксинов является липополисахарид (ЛПС), который является основным компонентом грамотрицательных бактериальных клеточных стенок и может вызывать острую воспалительную реакцию из-за высвобождения различными клетками большого количества воспалительных цитокинов 4,5. ЛПС индуцирует реакцию путем связывания с ЛПС-связывающим белком с последующим взаимодействием с комплексом CD14/TLR4/MD2 на миелоидных клетках. Это взаимодействие приводит к активации MyD88- и TRIF-зависимых сигнальных путей, что, в свою очередь, запускает ядерный фактор каппа В (NFkB). Транслокация NFkB в ядро инициирует продукцию цитокинов6. Моноциты и макрофаги очень чувствительны к ЛПС, и их воздействие на ЛПС приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и хемокинов (например, IL-6, IL-12, CXCL8 и TNF-α)7,8. Структура CD14 позволяет связывать различные виды ЛПС с одинаковым сродством и служит корецептором для других толл-подобных рецепторов (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 и 9)6. Количество исследований, проводимых о влиянии ЭВ на моноциты/макрофаги, все еще увеличивается 9,10,11. Особенно с точки зрения изучения функций моноцитов, их субпопуляций и других иммунных клеток большое значение имеет наличие эндотоксина и даже их замаскированное присутствие в ВВ12. Упущенное из виду загрязнение электромобилей эндотоксинами может привести к вводящим в заблуждение выводам и скрыть их истинную биологическую активность. Другими словами, работа с моноцитарными клетками требует уверенности в отсутствии загрязнения эндотоксинами13. Потенциальными источниками эндотоксинов могут быть вода, коммерчески получаемые среды и сыворотки, компоненты и добавки сред, лабораторная стеклянная посуда и пластмассовая посуда 5,14,15.

Таким образом, это исследование было направлено на разработку протокола выделения ВВ с низким содержанием эндотоксина. Протокол содержит простые подсказки о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время изоляции электромобилей вместо удаления эндотоксинов из электромобилей. Ранее было представлено множество протоколов о том, как удалять эндотоксины, например, из инженерных наночастиц, используемых в наномедицине; однако ни один из них не полезен для биологических структур, таких как электромобили. Эффективное депирогенирование наночастиц может быть осуществлено промывкой этанолом или уксусной кислотой, нагреванием при 175 °C в течение 3 ч, облучением γ или обработкой тритоном X-100; однако эти процедуры приводят к разрушению ЭВ16,17.

Представленный протокол является новаторским исследованием, направленным на предотвращение примесей эндотоксина в EV, в отличие от предыдущих исследований о влиянии EV на моноциты9. Применение предложенных принципов в лабораторной практике может помочь получить надежные результаты исследований, что может иметь решающее значение при рассмотрении потенциального использования ЭВ в качестве терапевтических агентов в клинике12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка ультрацентрифужных пробирок

  1. Используйте стерильные одноразовые пробирки. Если это невозможно, повторно используйте ультрацентрифужные пробирки после их мытья моющим средством с помощью стерильной пастеровской пипетки или других одноразовых аппликаторов. Помните, что ультрацентрифужные пробирки должны быть предназначены для одного типа центрифугируемого материала (надосадочная жидкость / сыворотка / плазма клеточной культуры) и вида (человек / мышь / и т. Д.).
  2. После стирки моющим средством промойте пробирки ультрацентрифуги деионизированной водой, не содержащей LPS, 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте некачественную воду.
  3. Высушите ультрацентрифужные пробирки, а затем заполните их 70% этанолом. Оставьте пробирки с 70% этанолом для ночной дезинфекции. Удалите этанол и снова высушите тюбики.
  4. Поместите тюбики и крышки в стерилизационную упаковку и плотно закройте их. Используют плазменную или газовую (окись этилена) стерилизациюметодом 18,19. Храните ультрацентрифужные пробирки, вложенные в стерилизационную упаковку, в сухом месте и используйте их до истечения срока годности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите ежемесячный мониторинг уровня LPS в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) и воде, используемой для изоляции электромобилей. Мониторинг должен также включать пробирки (например, путем тестирования воды [контроль промывки], которая хранилась в ультрацентрифужных пробирках в течение ночи при комнатной температуре [RT]).

2. Приготовление эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота с низким содержанием эндотоксинов с истощенным EV (EE-FBS)

  1. Убедитесь, что вы используете сверхнизкий уровень эндотоксина FBS (коммерчески доступен; см. Таблицу материалов; <0,1 ЕС / мл).
  2. Флакон со сверхнизким содержанием эндотоксина FBS поместить на водяную баню и инкубировать при 56 °C в течение 30 мин. Этот шаг необходим для инактивации системы комплемента.
  3. Пипеткой инактивированный FBS помещают в ультрацентрифужные пробирки и центрифугируют его при 100 000 x g в течение 4 ч при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость в стерильные пробирки объемом 50 мл, следя за тем, чтобы концентрация не превышала 45 мл на пробирку, чтобы избежать загрязнения колпачка и смачивания кольца пробирки.
  4. Храните сыворотку EE-FBS, приготовленную таким образом, при температуре -20 °C. Проверьте концентрацию ЛПС в EE-FBS (шаг 6). Концентрация ЛПС должна быть на том же уровне, что и до ультрацентрифугирования.

3. Клеточная культура

  1. Для этого исследования культивировали клеточные линии SW480 и SW620 в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко с глюкозой 4,5 г / л, L-глутамином, пируватом натрия и гентамицином (50 мкл / мл) с добавлением 10% EE-FBS соответственно в колбах для культуры размером 75 см2 с использованием асептической техники. Засейте почти 4,5 x 10 6 клеток и 6,5 x 106 клеток на колбу для SW480 и SW620 соответственно.
  2. Собирайте надосадочные жидкости два раза в неделю (~ 10 мл на колбу), когда клетки достигают полного слияния (~ 13,5 x 10 6 и 20 x 106 клеток на колбу для SW480 и SW620 соответственно), и разделяйте. Убедитесь, что жизнеспособность клеток составляет не менее 99% и что клетки культивируются при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
  3. Соберите надосадочные жидкости из клеточной культуры в соответствующим образом маркированные пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте собранные надосадочные жидкости при 500 x g в течение 5 мин при RT для удаления клеточного мусора.
  4. Тщательно соберите надосадочные жидкости, избегайте аспирационного мусора, поместите в маркированные пробирки и снова центрифугируйте при 3,200 x g в течение 12 мин при 4 ° C.
  5. Соберите надосадочные жидкости со второго этапа центрифугирования в стерильные пробирки объемом 50 мл с маркировкой. Избегайте смачивания краев трубок. Убедитесь, что объем надосадочной жидкости не превышает 45 мл и что пробирки держат вертикально.
  6. Оберните крышку пробирки стерильной прозрачной пленкой и храните надосадочные жидкости в вертикальном положении при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите ежемесячный контроль Mycoplasma spp. и контаминация ЛПС надосадочными веществами свежих культур (этап 6). Если уровень эндотоксина в надосадочных продуктах превышает 0,05 ЕС/мл, проверьте, на каком этапе могло произойти загрязнение, и возобновите процесс с самого начала. При контаминации клеточной культуры Mycoplasma spp. обнаружено, выделение ВВ из таких надосадочных пород следует прекратить.

4. Выделение ЭВ из надосадочных растений клеточных культур

  1. Подготовьте шприц-фильтры 0,22 мкм и шприцы нужного объема. Подготовьте две пробирки с культуральными надосадочными продуктами (90 мл).
  2. Наполните шприц надосадочной жидкостью и присоедините фильтр к адаптеру иглы. Поместите наполненный шприц с фильтром на пробирку объемом 50 мл. Нажмите на фланец плунжера и соберите ~ 90 мл фильтрата.
  3. Пипеткой нанесите фильтрат (7 мл) в ультрацентрифужные пробирки (убедившись, что в каждую пробирку для правильного баланса подается одинаковый объем) и центрифугу при 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность гранулирования электромобилей зависит от многих факторов (например, типа ротора, его k-фактора, длины пути миграции, вязкости среды и т. д.), которые необходимо оптимизировать для лучшего извлечения электромобилей20.
  4. Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью стерильной пастеровской пипетки. Соберите оставшиеся гранулы с помощью длинных отфильтрованных наконечников пипеток и объедините их в две ультрацентрифужные пробирки. Наполните их до 7 мл фильтрованным PBS без эндотоксинов, чтобы промыть электромобили.
  5. Центрифугу ресуспендированных гранул PBS при 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C. Полностью удалите надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки Пастера и добавьте 200 мкл отфильтрованного PBS без эндотоксинов в обе пробирки, чтобы ресуспендировать EV. Аккуратно нанесите гранулы электромобилей пипеткой, чтобы собрать все электромобили.
  6. Перенесите суспензию EVs в стерильную пробирку объемом 1,5 мл (по возможности используйте пробирку с низким связыванием белка). Оставьте 10 мкл суспензии EV для приготовления разбавления для анализа отслеживания наночастиц (NTA) и для других целей (например, для измерения концентрации белка).
  7. Разбавьте электромобили фильтрованным PBS (1:1,000) для измерений NTA в соответствии с инструкциями производителя. Закрепите трубки EV, обернув крышку стерильной прозрачной пленкой. Храните электромобили при температуре -80 °C.

5. Обнаружение специфических маркеров методом вестерн-блоттинга

  1. Определите уровень белка в образцах (например, с помощью анализа Брэдфорда) и подготовьте образцы (20 мкг) с загрузочным буфером. Приготовьте загрузочный буфер, смешав 5 мкл буфера для образца (4x) и 2 мкл восстановителя образца (10x) до общего объема 20 мкл. Инкубируйте образцы при 70 °C в течение 10 мин.
  2. Приготовьте полиакриламидные гели с SDS (10% -14%) и загрузите 20 мкг EV в каждую лунку.
  3. Проводят электрофорез с проточным буфером (30 г триса, 144 г глицина, 10% SDS на 1 л) в течение 45 мин при 150 В.
  4. Выполняют полусухой перенос белков из геля на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) в трансферной машине с буфером Towbin (1,51 г Tris, 7,2 г глицина, 10% метанола на 0,5 л) при 25 В в течение 1 ч.
  5. Поместите мембрану в буфер TBST (1 мл Tween, 100 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS 10x) на 1 л) для блокировки 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в буфере TBST и инкубируйте в течение 1 ч на коромысле при RT.
  6. Добавьте разбавленные (1:1000) антитела, анти-CD9 1 (клон # D8O1A) или анти-Аликс 1 (клон # 3A9), в1% BSA и инкубируйте с мембраной в течение ночи при 4 ° C на коромысле. Удалите антитела и промойте мембрану 3 раза 10 мл 1x TBST в течение 10 минут.
  7. Добавьте козье противокролиное или козье противомышиное (разведение: 1:2000) вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, в зависимости от первичного антитела на мембране, и инкубируйте в течение 1 ч на коромысле при ЛТ. Удалите антитела и промойте мембрану 3 раза 10 мл 1x TBST в течение 10 минут.
  8. Смешайте субстрат и люминол в соотношении 1:1, чтобы получить раствор объемом 1 мл. Вылейте раствор на мембрану. Немедленно поместите мембрану в измерительную камеру системы визуализации, выберите модуль хемилюминесценции и визуализируйте белковые полосы на экране.

6. Измерение уровня эндотоксина с помощью теста на лизат амебоцитов Limulus (LAL)

  1. Выполните хромогенное измерение уровня эндотоксина LAL в соответствии с рекомендацией производителя. Вкратце используйте метод, основанный на взаимодействии эндотоксина с лизатом амебоцитов лимула (LAL). Предел обнаружения этого метода составляет 0,005 ЕС / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ LAL, несмотря на его ограничения, в настоящее время остается стандартным методом обнаружения и количественной оценки загрязнения эндотоксинами в различных видах растворов и других продуктах, используемых в науке или медицине8. Ограничивающим фактором этого набора является стабильность восстановленного раствора лизата амебоцитов, который стабилен только в течение 1 недели при -20 ° C при замораживании сразу после восстановления.
  2. Используйте десятикратное разведение EV и других образцов и 50-кратное разведение сыворотки. Для дальнейших экспериментов используйте только реагенты с низким содержанием эндотоксина, такие как EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 ЕС / мл) и супернатанты культуры без ЛПС.

7. Обнаружение гена прокариотической 16S рРНК в образцах EV

  1. Выделите ДНК из образцов EV. Старайтесь, чтобы реактивы и место изоляции были асептическими. Измерьте концентрацию и качество ДНК (например, с помощью спектрофотометра).
  2. Проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР), как описано ранее21. Приготовьте 1,5% агарозный гель с бромидом этидия или зеленым SYBR для визуализации продуктов ПЦР в ультрафиолетовом свете (УФ).
  3. Проведите электрофорез образца и весового маркера с буфером TRIS-ацетат-ЭДТА при 75 В в течение 45 мин. Визуализируйте полосы ДНК с помощью системы визуализации.

8. Определение эффективной концентрации ЛПС для стимуляции в моноцитарной модели человека

  1. Приготовьте 2 x 106 моноцитов/мл суспензии моноцитов в RPMI 1640 с добавлением L-глютамина, глюкозы и 2% EE-FBS. Добавьте 50 мкл суспензии на лунку 96-луночной пластины22 для культивирования тканей.
  2. Добавьте надлежащий объем ЛПС или питательной среды для получения следующих конечных концентраций: 0 пг/мл (контроль), 10 пг/мл, 50 пг/мл, 100 пг/мл, 1 нг/мл и 100 нг/мл в общем объеме 100 мкл клеточной суспензии. Сделайте три раза каждую концентрацию ЛПС.
  3. Культивируют клетки в течение 18 ч при 37 °C, 5%CO2. Соберите надосадочную жидкость.
  4. Отжимайте надосадочную жидкость при 2,000 x g в течение 5 мин. Перенесите надосадочные жидкости в новые трубки. Измерьте концентрацию TNF 8,23 и IL-10 23 в собранных надосадочных продуктах с помощью набора цитокинов человека с помощью набора цитокинов человека с помощью массива цитометрических шариков (CBA) в соответствии с процедурой производителя с помощью проточного цитометра.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предпосылкой или обязательным этапом этого протокола является исключение возможного загрязнения эндотоксинами из реагентов. Все используемые реагенты, такие как FBS, DMEM, RPMI, PBS и даже ультрацентрифужные пробирки, должны не содержать эндотоксинов (<0,005 ЕС / мл). Поддерживать режим отсутствия загрязнения эндотоксинами непросто, поскольку, например, его богатым источником может быть обычная/стандартная сыворотка для клеточной культуры (0,364 ЕЭ/мл; см. Таблицу 1).

Хотя ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние несколько лет все большее значение приобретают методы надлежащей изоляции электромобилей, позволяющие проводить их дальнейший надежный анализ, например, в контексте получения надежных омиксных и функциональных данных24. Основываясь на предыдущем опыте исследований, представляется, что важны могут быть не только тип метода изоляции, но и другие условия во время этой процедуры. Использование FBS, обедненного электромобилем, широко признано необходимостью25,26...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть сконструированы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша, грант No 2019/33/B/NZ5/00647. Мы хотели бы поблагодарить профессора Томаша Госевского и Агнешку Кравчик с кафедры молекулярной медицинской микробиологии Медицинского колледжа Ягеллонского университета за их неоценимую помощь в обнаружении бактериальной ДНК в EV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Аликс (3A9) Мышь mAb Технология клеточной сигнализации2171
1250мкл фильтр Универсальные наконечники для пипеток, прозрачные, полипропиленовые, непирогенныеGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSКанто II Проточный цитометрBD Biosciences
CBA Набор цитокинов человека Th1/Th2BD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Технологияклеточной сигнализации13174
Система визуализации ChemiDocBio-Rad Laboratories, Inc. 
DMEM (Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, универсальный считыватель микропланшетовBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Фетальная бычья сывороткаGibco16000044
фетальная бычья сыворотка Южная Америка со сверхнизким содержанием эндотоксина  Биоуэст  S1860-500
Гентамицин, 50 мг/мл ПАН – BiotechP06-13100
Козий анти-мышиный IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Козий анти-кролик IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 
ЛПС из Salmonella abortus equi S-формы (TLRGRADE)  Энцо Лайф Сайенсиз, Инк.ALX-581-009-L002
Мини транс-блоттинг электрофоретическая передаточная клеткаBio-Rad Laboratories, Inc.
Анализ отслеживания наночастиц Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Буфер для образцов (4X)  Инвитроген  NP0007
NuPAGE Восстановитель проб (10x)  InvitrogenNP0004
Parafilm SigmaAldrichP7793прозрачная пленка
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Хромогенный эндотоксин Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube с уплотнительными крышкамиThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
Термоамплификатор SimpliAmpApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Центрифуга с роторомT-1270Система
субклеточной GTBio-Rad Laboratories, Inc. 
SuperSignal West Pico PLUS Хемилюминесцентный субстратThermo Scientific34577
SW480 клеточная линияAmerican Type Culture Collection (ATCC)
SW480 клеточная линияAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Шприцевой фильтр 0,22 мкмTPP99722
Trans-Blot SD Полусухая передаточная ячейкаБио-Рад Лаборатории, Инк. 1703940Передаточный аппарат
Передаточный пипетка, 3,5 млSARSTEDT86.1171.001
II mAb кролика 1700140116201771703930 горизонтального электрофореза Thermo Scientific 75000100 1704401

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750(2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273(2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27(2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low EndotoxinExtracellular VesiclesCancer Cell LinesEndotoxin free ReagentsContamination AvoidanceAseptic ProcedureCentrifugationUltracentrifugeSupernatant CollectionSW480SW620UltracentrifugationFiltered PBSSterile TechniquesPellet Resuspension