Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Двухцветное оптическое картирование сердец у мышей RyR2R2474S с катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65082

⸱

22 декабря 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол вводит оптическое картирование сердца мышей с двойным окрасителем, полученное от животных дикого типа и животных, пораженных катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией, включая электрофизиологические измерения трансмембранного напряжения и внутриклеточных транзиентовCa2+ с высоким временным и пространственным разрешением.

Аннотация

Проаритмическое заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может ухудшиться до потенциально смертельной фибрилляции желудочков. Сердце мыши является широко распространенным видом для моделирования наследственных заболеваний сердечной аритмии, включая CPVT. Одновременное оптическое картирование трансмембранного потенциала (Vm) и кальциевых транзиентов (CaT) из перфузионных сердец мышей по методу Лангендорфа может пролить свет на механизмы, лежащие в основе аритмогенеза. По сравнению с исследованием на клеточном уровне, метод оптического картирования позволяет проверить некоторые электрофизиологические параметры, такие как определение активации, скорости проводимости, длительности потенциала действия и длительности CaT. В данной работе представлена приборная установка и экспериментальная методика для высокопроизводительного оптического картирования CaT и Vm в мышиных сердцах дикого типа и гетерозиготных сердец RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и во время испытания изопротеренолом. Этот подход продемонстрировал осуществимый и надежный метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в препарате сердца мыши ex vivo .

Введение

Наследственное заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии (ПВТ) после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может перерасти в потенциально смертельную фибрилляцию желудочков 1,2,3,4 . Недавние данные, полученные после первого сообщения о клиническом синдроме в 1995 году, указывают на мутации в семи генах, все из которых участвуют в высвобождении Са2+ в саркоплазматическом ретикулярном (СР) запасе Ca2+ при этом состоянии: наиболее часто сообщаемый RYR2, кодирующий рианодиновый рецептор 2 (RyR2) каналов высвобожденияCa2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2, кодирующий сердечный кальсеквестрин8, TRDN кодирует соединительный белок SR триадин 9, а CALM1 9, CALM2 10 и CALM3 идентично кодирует кальмодулин11,12. Эти генотипические паттерны связывают аритмические события с нерегулируемым патологическим высвобождением запаса SR Ca2+12.

Спонтанное высвобождение Ca2+ из SR может быть обнаружено в виде искр Ca2+ или волн Ca2+, что активирует обменник Na+/Ca2+ (NCX). Обменник одного Ca2+ на три Na+ генерирует внутренний ток, который ускоряет диастолическую деполяризацию и доводит мембранное напряжение до порога потенциала действия (AP). У мышей с нокаутом RyR2 повышенная активность RyR2R4496C в синоатриальном узле (SAN) приводит к непредвиденному снижению автоматизма SAN за счет Ca2+-зависимого снижения истощения ICa,L и SRCa2+ во время диастолы, что позволяет выявить субклеточные патофизиологические изменения, способствующие дисфункции SAN у пациентов с CPVT13,14. Возникновение соответствующих цитозольных волн Ca2+ кардиомиоцитов более вероятно после увеличения фонового цитозольного [Ca2+] после сенсибилизации RyR катехоламином, включая изопротеренол (ISO).

Детальные кинетические изменения в передаче сигналов Ca2+ после RyR2-опосредованного высвобожденияCa2+ в ответ на активацию потенциала действия (AP), которые могут быть причиной наблюдаемых желудочковых аритмий в интактных моделях CPVT сердца, еще предстоит определить для всего спектра зарегистрированных генотипов RyR212. В данной работе представлена приборная настройка и экспериментальная методика высокопроизводительного картирования сигналов Ca2+ и трансмембранных потенциалов (Vм) в мышиных сердцах дикого типа (WT) и гетерозиготных RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и после изопротеренолового вызова. Этот протокол представляет собой метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в изолированных сердцах мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для экспериментов использовали самцов мышей дикого типа в возрасте от 10 до 14 недель или мышей RyR2-R2474S/+ (на фоне C57BL/6) массой 20-25 г. Все процедуры были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию Юго-Западного медицинского университета, Сычуань, Китай (одобрение NO:20160930) в соответствии с национальными руководящими принципами, в соответствии с которыми работает учреждение.

1. Подготовка

  1. Складские решения
    1. Исходный раствор блеббистатина: Добавьте 1 мл 100% диметилсульфоксида (ДМСО) в исходную колбу, содержащую 2,924 мг (-) порошка блеббистатина, до достижения концентрации 10 мМ.
    2. Индикатор напряжения Исходный раствор RH237: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в оригинальную колбу с 1 мг порошка RH237 до достижения концентрации 2,01 мМ.
    3. Кальциевый индикатор Исходный раствор Rhod-2 AM: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в 1 мг порошка Rhod-2 AM до достижения концентрации 0,89 мМ.
    4. Исходный раствор Pluronic F127: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в 200 мг Pluronic F127 до достижения концентрации 20% по массе (0,66 мМ).
    5. Аликвотируют исходные растворы в 200-мкл ПЦР-пробирок в 21-51 мкл (21 мкл RH237, 31 мкл Rhod-2 AM и 51 мкл блеббистатина) для однократного или двукратного использования, чтобы избежать повторного замораживания и размораживания. Затем оберните растворы алюминиевой фольгой и храните при температуре -20 °C, за исключением исходного раствора Pluronic F127, помещенного в темное помещение при температуре окружающей среды.
  2. Раствор для перфузии
    1. Раствор Кребса (в мМ): Приготовьте 1 л раствора Кребса (NaCl 119, NaHCO3 25, 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 и глюкоза 10).
    2. Отфильтруйте раствор с помощью асептического игольчатого фильтра 0,22 мкм и насыщайте кислородом 95% O 2/5% CO2.
    3. Возьмите 40 мл раствора Кребса в центробежную пробирку объемом 50 мл и храните ее при температуре 4 °C для последующей изоляции сердца.
  3. Перфузионная система Лангендорфа и устройство оптического картирования
    1. Установите перфузионную систему Лангендорфа.
      1. Включите водяную баню и установите температуру 37 °C.
      2. Промойте перфузионную систему Лангендорфа 1 л деионизированной воды.
      3. Прокачать раствор из впускного тракта и отрегулировать скорость оттока до 3,5-4 мл/мин. Затем насыщают перфузат кислородом O 2 / CO2 (95%/5%) при 37 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки никогда не допускаются в системе перфузии.
    2. Подготовьте систему оптического картографирования.
      1. Установите камеру с электронным умножением зарядовой связи (EMCCD) (512 × 512 пикселей), объектив (40-кратное увеличение), светоизлучающие диоды (LED) с делителем длины волны, монитор электрокардиограммы (ЭКГ) и электрод стимуляции (рис. 1).
      2. Отрегулируйте правильное рабочее расстояние от объектива до положения сердца.
      3. Установите два светодиода в диагональном положении термостатической ванны для равномерного освещения, обеспечивая длину волны 530 нм для генерации возбуждающего света. Используйте фильтр ET525/50 с напылением для удаления внешнего света для светодиодов.
      4. Отрегулируйте переключатель ручки так, чтобы он был равен квадрату целевой поверхности, чтобы изображения напряжения и кальция отображались адекватно на интерфейсе сбора данных.
      5. Поверните диафрагму объектива до максимального диаметра, чтобы избежать утечки сигналов напряжения или кальция.
      6. Отрегулируйте объектив камеры на правильной высоте, так как он служит прекрасным рабочим расстоянием до термостатической ванны, в основном используется 10 см.
      7. Включите камеру, чтобы обеспечить стабильную температуру отбора проб при -50 °C.

2. Процедуры

  1. Сбор, канюляция и перфузия сердца мыши
    1. Животным внутрибрюшинно вводят раствор авертина (1,2%, 0,5-0,8 мл) и гепарин (200 ЕД), чтобы свести к минимуму страдания и болевой рефлекс и предотвратить образование тромбов. Через 15 минут жертвуют животных при вывихе шейки матки.
    2. Вскройте грудную клетку ножницами, осторожно соберите сердце и поместите его в холодный раствор Кребса (4 °C, 95% O 2, 5% CO2), чтобы замедлить обмен веществ и защитить сердце.
    3. Удалить окружающие ткани аорты, канюлировать аорту с помощью специально изготовленной канюлирующей иглы (наружный диаметр: 0,8 мм, внутренний диаметр: 0,6 мм, длина: 27 мм) и зафиксировать шелковым швом 4-0.
    4. Перфузия сердца системой Лангендорфа с постоянной скоростью 3,5-4,0 мл/мин и поддержание температуры на уровне 37 ± 1 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие процедуры выполняются в этом состоянии.
    5. Вставьте небольшую пластиковую трубку (диаметр 0,7 мм, длина 20 мм) в левый желудочек, чтобы уменьшить скопление раствора в камере и избежать перегрузки.
  2. Разъединитель возбуждения-сжатия и двойной нагрузки красителя
    1. Вставьте два провода в перфузат в ванне, включите питание блока усилителя ЭКГ и контроллера электростимуляции, а затем запустите указанное программное обеспечение ЭКГ и непрерывно контролируйте ЭКГ.
    2. Последующие действия выполняйте в темноте, когда сердце достигнет стабильного состояния (сердце ритмично бьется с частотой ~400 уд/мин).
    3. Смешайте 50 мкл 10 мМ исходного раствора блеббистатина с 50 мл раствора Кребса до достижения концентрации 10 мкМ. Постоянно вводите смесь раствора блеббистатина-Кребса в сердце в течение 10 минут, чтобы отделить сокращение от возбуждения и избежать артефактов сокращения во время съемки.
    4. Используйте красный фонарик, чтобы проверить, полностью ли прекращается сокращение сердца, потому что сокращение повлияет на качество загрузки красителя.
    5. После развязки возбуждения-сжатия смешать 15 мкл исходного раствора Rhod-2 AM с 15 мкл исходного раствора Pluronic F127 в 50 мл раствора Кребса до достижения конечных концентраций 0,267 мкМ Rhod-2 AM и 0,198 мкМ Pluronic F127. Затем непрерывно перфузии сердца рабочим раствором Rhod-2 AM в течение 15 мин в перфузионной системе Лангендорфа.
    6. Поддерживайте поступление кислорода во время внутриклеточной загрузки кальциевым красителем. Поскольку в Pluronic F127 легко образуются пузырьки, вставьте пузырьковую ловушку в перфузионную систему, чтобы избежать газовой эмболизации коронарных артерий.
    7. Разбавьте 10 мкл исходного раствора RH237 в 50 мл перфузата до достижения конечной концентрации в 0,402 мкМ и выполняйте нагрузку в течение 10 минут.
    8. В конце загрузки двойного красителя сделайте серию фотографий, чтобы убедиться, что сигналы напряжения и кальция достаточны для анализа (нет взаимодействия между двумя сигналами).
  3. Оптическое картирование и индукция аритмии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое картирование начинается после прекращения схваток и соответствующей загрузки красителя, и сердце последовательно перфузируется, как описано выше в 2.1 (4).
    1. Включите два светодиода для возбуждающих ламп и отрегулируйте их интенсивность в нужном диапазоне (достаточно мощном для освещения и относительно простой съемки, но не слишком сильном для передержки).
    2. Поместите сердце под устройство обнаружения, убедитесь, что оно находится под достаточным освещением двух светодиодов, и отрегулируйте диаметр светового пятна до 2 см.
    3. Установите рабочее расстояние от объектива до сердца на 10 см, что даст частоту дискретизации почти 500 Гц и пространственное разрешение 120 x 120 мкм на пиксель.
    4. Откройте программное обеспечение для выборки сигналов, чтобы управлять камерой в цифровом виде для одновременного захвата сигналов напряжения и кальция.
    5. Запустите стимулятор поля миопака и установите паттерн стимуляции на Transistor Transistor Logic (TTL), длительность кардиостимуляции 2 мс для каждого импульса и 0,3 В в качестве начальной интенсивности.
    6. Используйте 30 последовательных стимулов S1 с частотой 10 Гц для проверки порога диастолического напряжения сердца, управляемого программным обеспечением для записи ЭКГ. Постепенно увеличивайте амплитуду напряжения до тех пор, пока не будет реализован захват 1:1 (проверьте волну QRS с монитора ЭКГ, потенциал действия (AP) и сигналы переходных процессов кальция (CaT).
    7. После определения порога напряжения обработайте сердце с интенсивностью, в 2 раза превышающей порог диастолического напряжения, с помощью пары платиновых электродов, прикрепленных к эпикарду верхушки левого желудочка (LV) (ELVA).
    8. Реализуйте протокол S1S1 для измерения кальция или альтернативных свойств потенциала действия и реституции. Последовательно выполняйте сердечный ритм с основной продолжительностью 100 мс, уменьшая длину цикла на 10 мс с каждой последующей последовательностью, пока не будет достигнуто 50 мс. Каждый эпизод включает в себя 30 последовательных стимулов с длительностью импульса 2 мс. В то же время перед стимуляцией начинайте оптическое картирование (время выборки включает ~10 синусовых ритмов и длительность стимуляции).
    9. Чтобы измерить эффективный рефрактерный период желудочков (ERP) с помощью протокола стимуляции S1S2, начните с длительности цикла стимуляции S1S1 100 мс с S2 в сочетании с 60 мс с шагом 2 мс до тех пор, пока S2 не захватит эктопический QRS-комплекс.
    10. Для индукции аритмии проводят непрерывную импульсную стимуляцию с частотой 50 Гц (50 непрерывных электрических стимуляций с длительностью импульса 2 мс) и выполняют тот же эпизод стимуляции после 2-секундного интервала отдыха.
    11. Внимательно наблюдайте за записями ЭКГ в течение непрерывного периода высокочастотной стимуляции, чтобы одновременная запись оптического картирования могла начаться сразу при возникновении интересной аритмичной волны ЭКГ (поскольку большинство сердечных аритмий индуцируются электрической стимуляцией, оптические сигналы дискретизируются за 2-3 с до пиковой стимуляции в случае потери важных сердечных событий).
    12. Изображение получено с помощью камеры EMCCD (частота дискретизации: 500 Гц, размер пикселя: 64 x 64).
  4. Анализ данных
    1. Загрузка изображений и обработка сигналов
      1. Нажмите Select Folder and Load Images, чтобы загрузить изображения в программное обеспечение для получения изображений для полуавтоматического анализа массивных видеоданных в соответствии с настройками и протоколами, описанными выше15,16.
      2. Введите правильные параметры выборки (например, размер пикселя и частоту кадров).
      3. Установите порог изображения с помощью ручного ввода и выберите область интереса (ROI).
      4. Реализуйте пространственный фильтр Гаусса размером 3 x 3 пикселя, фильтр Савицкого-Гоали и коррекцию базовой линии цилиндра.
      5. Нажмите Process Images, чтобы удалить базовую линию и рассчитать электрофизиологические параметры, такие как APD80 и CaTD50.
    2. Анализ электрофизиологических параметров
      1. Установите время начала APD на пике и конечную точку на 80% реполяризации (APD80) для расчета APD80. Аналогично, время начала CaTD определяется как пик, а конечная точка определяется как 80%-ная релаксация.
      2. Измерение скорости проводимости (CV) зависит от размера пикселя и времени проводимости потенциала действия между двумя пикселями или более. Вычислите среднюю скорость из всех выбранных пикселей - это средняя скорость проводимости выделенной области. Одновременное создание соответствующих изохрональных карт для четкого представления направления проводимости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: O'Shea et al.15 подробно сообщили об измерении CV.
      3. Для анализа альтернанов и аритмий кальциевые альтернаны определяются как непрерывная большая и малая пиковая амплитуда, появляющаяся попеременно. Используйте коэффициент пиковой амплитуды для оценки тяжести частотно-зависимых альтернанов (1-A2/A1). Применяйте фазовые карты для анализа сложных аритмий, таких как желудочковая тахикардия (ЖТ). Обратите внимание на роторы, отчетливо появляющиеся в определенной области при их смещении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптическое картирование является популярным подходом при изучении сложных сердечных аритмий в последнее десятилетие. Установка оптического картографирования состоит из камеры EMCCD, обеспечивающей частоту дискретизации до 1 000 Гц и пространственное разрешение 74 x 74 мкм для каждого пикселя. Это обеспечивает достаточно высокое соотношение сигнал/шум при дискретизации сигнала (рис. 1). После того, как сердце, перфузионированное по Лангендорфу, достигает стабильного состояния и завершается за...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основываясь на нашем опыте, мы пришли к выводу, что ключом к успешному оптическому картированию сердца мыши с использованием двойного красителя являются хорошо подготовленный раствор и загрузка сердца, красителя, достижение наилучшего соотношения сигнал/шум и уменьшение артефактов движения.

Приготовление раствора
Раствор Кребса необходим для успешного эксперимента на сердце. Исходные растворы MgCl2 и CaCl2 (1 моль/л) готовят заранее с учетом их водопоглощения и д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у кого из авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Это исследование поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81700308 для XO и 31871181 для ML и 82270334 для XT), Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (CN) (2021YJ0206 для XO, 23ZYZYTS0433 и 2022YFS0607 для XT и 2022NSFSC1602 для TC) и Государственной ключевой лабораторией химии и молекулярной инженерии медицинских ресурсов (Педагогический университет Гуанси) (CMEMR2017-B08 для XO), MRC (от G10031871181 до ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE в Оксфорде (ML).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m шприцевой фильтрЗавод медицинского оборудования Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Шанхай, КитайН/ДДля фильтрации раствора
15 мл центрифужная трубкаGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. КитайCFT011150
1 мл пипетка ПастераBeijing Labgic Technology Co., Ltd. Китай00900026
1 мл шприцаB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μ L ПЦР-пробиркаSangon Biotech Co., Ltd. Шанхай. КитайF611541-0010Aliquote стоковые растворы  для предотвращения повторного замораживания и размораживания
центрифужной трубки объемом 50 млGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. КитайCFT011500хранить раствор Tyrode по адресу 4 ° C для последующей изоляции сердца
фильтр 585/40 нмChroma TechnologyN/AФильтр для сигнала кальция
630 нм длинночастотный фильтрChroma TechnologyG15604AJФильтр для сигнала напряжения
Авертин (2,2,2-триброметанол)Sigma-Aldrich Poole, Дорсет, ВеликобританияT48402-100GДля минимизации страданий и боли рефлекс
BlebbistatinTocris Bioscience, Миннеаполис, Миннесота, СШАSLBV5564Развязка возбуждения-сжатия к устранению артефакта движения во время картирования
CaCl2Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАSLBK1794VДля решения Tyrode
Изготовленная на заказ термостатическая ваннаMappingLab, ВеликобританияTBC-2.1Для поддержания температуры перфузионного раствора
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Растворитель для красителей
Щипцы Dumont Заводмедицинского оборудования Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Шанхай, КитайYAF030
Программное обеспечение ElectroMapУниверситет БирмингемаN/AКоличественная оценка электрических параметров
EMCCD камераEvolve 512 Delta, Фотометрика, Тусон, Аризона, СШАA18G150001Получение изображений для оптических сигналов
ET525/36 с напылением фильтрс покрытием Chroma Technology319106Возбуждающий фильтр
GlucoseSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАSLBT4811VДля раствора Tyrode
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Чэнду, Китай(H51021209)Для предотвращения образования тромбов в коронарной артерии
  Ирисовые щипцыЗавод медицинского оборудования Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd., Шанхай, КитайYAA010
ИзопротеренолMedChemExpress, Карлсбад, Калифорния, СШАHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАSLBS5003Для решения Tyrode
MacroLEDCairn Research, Фавершам, Великобритания7355/7356Возбуждающий свет флуоресцентных зондов
MacroLED источник светаCairn Research, Фавершам, Великобритания7352Управление светодиодами
ножницы MayoЗавод медицинского оборудования Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Шанхай, КитайYBC010
MetaMorph Molecular DevicesN/AОптическая выборка сигналов
MgCl2Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАBCBS6841VДля решения Tyrode
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, ВеликобританияM5337Подключите электростимулятор и программное обеспечение Spike2
MyoPacer EP полевой стимуляторIon Optix Co, Милтон, Массачусетс, СШАS006152Электрический стимулятор
NaClSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАSLBS2340VДля решения Tyrode
2PO4  Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАBCBW9042Для решения Tyrode
NaHCO3Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАSLBX3605Для решения Tyrode
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229Для усилителя ЭКГ
OmapScope5MappingLab, ВеликобританияN/AКальциевые альтернаны и анализ аритмии
Офтальмологические ножницыHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Цзян Су, КитайT4-3904
OptoSplitCairn Research, Фавершам, Великобритания6970Разделение света излучения для обнаружения Ca2+ и Vm  одновременно
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, BT100-2JДля прокачки раствора
чашка ПетриBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США1899021Для усиления нагрузки с помощью Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, США1971387Потенциал-чувствительный краситель
Rhod-2 AMInvitrogen, Карлсбад, Калифорния, США1890519Индикатор кальция
Силикагелевая трубкаLong Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Китай,96402-16Соедините с перистальтическим насосом
Silk SutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd., Янчжоу, Китай20172650032Для фиксации аорты
Spike2Cambridge Electronic Design limited, ВеликобританияN/AДля записи и анализа данных ЭКГ
Стимуляция электродMappingLab, ВеликобританияSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461Для источника света
T565lpxrChroma Technology321343Для источника света

Ссылки

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314(2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

RyR2
Двухцветное оптическое картирование сердец у мышей RyR2R2474S с катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.