Индукция стриктуры уретры с последующей уретропластикой слизистой оболочки полости рта на модели крысы

Краткое содержание

В настоящем протоколе у крыс линии Wistar была разработана индукция стриктуры уретры с последующей реконструкцией уретры с использованием трансплантата слизистой оболочки щеки. Была проведена ретроградная уретрограмма и лазерная допплерография, валидация реконструкции уретры (после формирования стриктуры) и установки трансплантата.

Аннотация

Реконструкция уретры является важной областью специализации урологов. Слизистая оболочка щек считается лучшим вариантом, когда необходима пересадка уретры, хотя в некоторых случаях она нецелесообразна или нуждается в оптимизации для восстановления данной стриктуры. Таким образом, разработка инновационных процедур и оценка их предполагаемого успеха на экспериментальных моделях имеет решающее значение для удовлетворения клинических потребностей. С этой целью в данном исследовании описывается протокол, в котором стриктура уретры индуцировалась электрокоагуляцией у крыс линии Wistar. Реконструкция уретры была выполнена через 1 неделю с помощью трансплантата слизистой оболочки щеки, взятого из нижней губы и помещенного вентральным накладкой. Ретроградная уретрограмма показала достоверное улучшение диаметра уретры после уретропластики по сравнению с соответствующим значением после индукции стриктуры. Дополнительно размещение трансплантата оценивали с помощью анализа перфузии крови с помощью лазерной допплерографии. Как и ожидалось, темно-синий участок соответствовал неваскуляризированному трансплантату слизистой оболочки щеки. Эта процедура может успешно имитировать нормальный патофизиологический процесс повреждения уретры и модуляции тканей, а также реконструкцию уретры с использованием трансплантата слизистой оболочки щеки воспроизводимым образом, и служить основой для будущих исследований, основанных на тканевой инженерии или трансплантатах уретры.

Введение

Реконструкция уретры является серьезной проблемой для хирургов-урологов при лечении повреждений уретры на фоне стриктур, травм или врожденных дефектов¹. С лечебной целью уретропластика является методом выбора для большинства пациентов с длинными (>2 см) и передними дефектами уретры, требующими той или иной формы заместительной уретропластики². В качестве заменителей уретры используются многие ткани, в том числе полноценные или расщепленные кожные трансплантаты генитальных или экстрагенитальных областей, слизистой оболочки стенки мочевого пузыря или широко распространенной слизистой оболочки щек². Трансплантаты слизистой оболочки щеки имеют ряд преимуществ, таких как получение из влажной и безволосой среды, простота сбора, устойчивость к инфекции, толстый эпителий, снижение вероятности образования псевдодивертикулов и тонкая пластинка, обеспечивающая раннее поглощение и инокуляцию³. В отличие от лоскутов, трансплантаты не имеют кровоснабжения, в зависимости от сосудистого русла реципиента, чтобы выжить⁴.

Животные модели трансплантатов или лоскутов широко использовались для разработки или совершенствования хирургических методов, изучения и понимания физиологии тканей, лежащих в основе механизмов и причин неудачи, а также оценки инновационных стратегий лечения ^5,6. Несмотря на то, что более крупные животные облегчают техническую работу, грызуны, а именно крысы и мыши, проще в обращении и содержании, устойчивы к болезням, более экономичны и, что немаловажно, обладают инструментами для исследования молекулярных механизмов, имеющих решающее значение для тестирования инновационных методов ^{лечения.} У крыс было описано несколько моделей лоскутов и трансплантатов с использованием различных тканей, а именно кожи, костей, мышц⁶, сосудов⁵ и даже твердых органов⁷. Тем не менее, на мышиных моделях трансплантатов для реконструкции уретры или тканевой инженерии проводится мало исследований.

Тем не менее, прогресс в трансляционной науке зависит от животных моделей, которые имитируют болезнь. До сих пор локальная патофизиологическая среда не была изучена, так как реконструкция уретры выполняется сразу после ее стриктуры. Целью данного исследования является проведение реконструкции уретры с использованием трансплантата слизистой оболочки щеки в местной патофизиологической среде. С этой целью стриктуру уретры индуцировали за 1 неделю до ее реконструкции. Эта экспериментальная модель, выполненная на крысах, позволяет в будущем тестировать инновационные методы лечения и исследовать их молекулярные механизмы и клинические преимущества.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС. Процедуры были одобрены институциональным Органом по защите животных, лицензированным DGAV, португальским компетентным органом по защите животных (номер лицензии 0421/000/000/2021). В настоящем исследовании использовали крыс-самцов Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) (400-500 г) в возрасте 12-14 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Приготовление растворов

1. Обезболивающий раствор
   1. Наполните шприц объемом 3 мл 2,3 мл медетомидина (1 мг/мл; 0,715 мг/кг массы тела) и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Наполните шприц объемом 3 мл 1,55 мл фентанила (0,05 мг/мл; 0,02 мг/кг массы тела) и перелейте в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   3. Наполните шприц объемом 10 мл 6,15 мл мидазолама (5 мг/мл; 9,5 мг/кг массы тела) и перелейте в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл, получив таким образом раствор анестетика объемом 10 мл.
   4. Наклейте этикетку на тюбик и храните его при температуре 4 °C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта комбинация анестетиков (медетомидин, фентанил и мидазолам) обеспечивает хирургическое окно анестезии до 3 часов. Применение атипамезола и флумазенила может обратить эффект вспять.
2. Антиседативный раствор
   1. Наполните шприц объемом 1 мл 0,7 мл атипамезола (5 мг/мл; 3,72 мг/кг массы тела) и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Наполните шприц объемом 10 мл 9,3 мл флумазенила (0,1 мг/мл; 1,56 мг/кг массы тела) и перелейте в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл, получив таким образом 10 мл противоседативного раствора.
   3. Наклейте этикетку на тюбик и храните его при температуре 4 °C в темноте.
3. Послеоперационные обезболивающие растворы
   1. Наполните шприц объемом 1 мл 0,5 мл карпрофена (50 мг/мл; 5 мг/кг массы тела) и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Добавляют 9,5 мл раствора NaCl (0,9%), получая 10 мл раствора карпрофена.
   3. Наполните шприц объемом 1 мл 1 мл бупренорфина (0,3 мг/мл; 0,01-0,05 мг/кг массы тела) и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   4. Добавляют 9 мл раствора NaCl (0,9%), получая 10 мл раствора бупренорфина.
   5. Наклейте этикетки на тюбики и храните их при температуре 4 °C в темноте.
4. Периоперационный антибиотик
   1. Наполните шприц объемом 2,5 мл 2,5 мл энрофлоксацина (25 мг/мл; 10 мг/кг массы тела) и перелейте в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Добавляют 7,5 мл раствора NaCl (0,9%), получая 10 мл раствора энрофлоксацина.
   3. Наклейте этикетку на тюбик и храните его при температуре 4 °C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех реагентах для приготовления вышеуказанных растворов приведена в таблице материалов.

2. Хирургическая индукция стриктуры уретры

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры проводились с использованием стереомикроскопа (10x) (см. Таблицу материалов).

1. Перед использованием простерилизуйте все хирургические инструменты: лезвие скальпеля (номер 11), остроконечные щипцы, пружинные ножницы, хирургические щипцы, офтальмологический иглодержатель, хирургические ножницы и иглодержатель. Используйте стерильные ватные шарики для очистки операционного поля.
2. Наполните шприц раствором анестетика перед тем, как держать крысу в руках.
3. Удерживайте животное с помощью трубки или полотенца и приподнимайте хвост, чтобы обнажить живот.
4. Удерживайте животное в пристегнутом состоянии и выполняйте внутрибрюшинную инъекцию раствора анестетика (приготовленного на шаге 1.1).
5. Проверьте рефлексы отторжения педали крысы, чтобы оценить анестезию.
6. Нанесите защитный гель на оба глаза животного. Выполняют подкожную инъекцию раствора антибиотика (приготовленного на этапе 1.1) в дозе 10 мг/кг массы тела.
7. Поместите крысу в положение спинного пролежня на подогревательную подушку и используйте диссекционный микроскоп с 10-кратным или 20-кратным увеличением для выполнения хирургической процедуры.
8. Очистите половой член и окружающую кожу живота повидон-йодом (100 мг/мл).
9. Вручную втяните крайнюю плоть и наложите поверхностный шов (шов 7,0; см. Таблицу материалов) в дорсальной части головки полового члена, чтобы оказать вытяжение на половой член, оставив иглодержатель на месте, чтобы пенис удерживался втянутым.
10. Поместите венозный катетер 22 G в мочеиспускательный канал для катетеризации с помощью лубрикантного геля.
11. С помощью лезвия хирургического скальпеля (No 11) выполните продольный вентральный разрез 1 см в коже полового члена.
12. С помощью заостренных щипцов и пружинных ножниц рассеките слои ткани полового члена до тех пор, пока не обнажите мочеиспускательный канал на уровне середины стержня.
13. С помощью устройства для электрокоагуляции (см. Таблицу материалов) подайте ток мощностью 10 Вт, в течение 1 с, в боковые стороны мочеиспускательного канала (в одном месте с каждой стороны), вентрально на уровне середины ствола полового члена.
14. Закройте разрез рассасывающимся протекающим шовным материалом 6,0 (см. Таблицу материалов).
15. Извлеките уретральный катетер. Снимите шов для вытяжения полового члена.
16. Выполняют подкожные инъекции анальгезии: карпрофена в дозе 5 мг/кг массы тела и бупренорфина в дозе 0,03 мг/кг массы тела.
17. Наполните шприц противоседативным раствором (приготовленным на шаге 1.2) и, когда животное находится в брюшном пролежне, наложите палатку на дряблую кожу, чтобы ввести подкожную инъекцию противоседативного раствора.

3. Хирургическая процедура уретропластики трансплантатом слизистой оболочки щеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры проводились с использованием стереомикроскопа (10x) (см. Таблицу материалов).

1. Простерилизуйте все хирургические инструменты, необходимые для этого вмешательства: остроконечные щипцы, пружинные ножницы, офтальмологический иглодержатель, хирургические ножницы, иглодержатель, три противомоскитных щипца и лезвие скальпеля (номер 11). Используйте маленькие губки для очистки операционного поля.
2. Введите анестетик, антибиотик, удерживающее средство и поместите животное, как описано ранее (шаги 2.2-2.8).
3. Очистите слизистую оболочку нижней губы, полового члена и окружающую кожу живота с помощью повидон-йода (100 мг/мл).
4. Наложите три шва (7,0 швов) на нижнюю губу, с обеих сторон и посередине, и оставьте в каждом из них комара, чтобы втянуть нижнюю губу и обнажить внутреннюю слизистую оболочку.
5. Используя пружинные ножницы и заостренные щипцы, возьмите трансплантат диаметром 4 мм внутренней слизистой оболочки нижней губы и поместите его в небольшой реципиент со стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl).
6. Наложить компрессию в донорскую область губкой для гемостаза.
7. Снимите ранее наложенные швы нижней губы.
8. Обнажите половой член, как описано ранее (шаг 2.9).
9. Поместите венозный катетер 22 G в мочеиспускательный канал для катетеризации с помощью лубрикантного геля.
10. С помощью пружинных ножниц выполните круговой, субкорональный разрез и снимите перчатку с полового члена до основания.
11. С помощью заостренных щипцов и пружинных ножниц рассеките оставшиеся слои и обнажите мочеиспускательный канал.
12. С помощью лезвия хирургического скальпеля (No 11) и пружинных ножниц выполняют продольный вентральный разрез, начиная на 3 мм дистальнее венечной борозды в расширении 4 мм, шпатунируя мочеиспускательный канал на уровне ранее введенной стриктуры (шаг 2).
13. Наложите два шва из материала 7,0, по одному с каждой стороны шва, и оставьте в каждом из них комара, чтобы втянуть мочеиспускательный канал.
14. Наложите два нерассасывающихся шва 7,0, по одному на каждом конце шпателя.
15. Установите трансплантат слизистой оболочки щеки вентральной накладкой так, чтобы сторона слизистой оболочки была обращена к просвету уретры.
16. Пропустите один из швов через конец трансплантата и выполните полуэллипс с ходовым шовом.
17. Повторите шаги 3.15 и 3.16 с другим швом на другой стороне трансплантата.
18. Извлеките уретральный катетер. Измените положение кожи полового члена.
19. Закройте окружной, субкорональный разрез рассасывающимся прерывистым швом 6,0.
20. Снимите шов для вытяжения полового члена.
21. Введите анальгезию, а затем антиседативный раствор, как описано в шагах 2.16-2.17.

4. Послеоперационное наблюдение

1. Наблюдайте за крысами три-четыре раза каждый час, подтверждая их выздоровление от наркоза. Контролируйте дыхание и оценивайте педальные и глазные рефлексы.
2. Подкожно вводят обезболивание каждые 12 ч в течение 48 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Карпрофен вводили в дозе 1 мл/500 мг массы тела, а бупренорфин – в дозе 0,5 мл/500 мг массы тела (см. Таблицу материалов).
3. Обеспечьте мягкую пищу в течение 48 часов после каждой процедуры и воду вволю.
4. Ежедневно наблюдайте за крысами после операции и регистрируйте состояние их здоровья и внешний вид в месте операции. Оцениваемые признаки включают выражение лица, вокализацию, состояние активности, любые признаки боли, прием пищи и напитков, мочеиспускание и кровотечение.

5. Оценка перфузии крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Кровоток измеряется непосредственно перед индукцией стриктуры, непосредственно перед уретропластикой и сразу после уретропластики.

1. Проведение лазерной допплеровской перфузионной визуализации.
   1. Обезболивайте крыс с помощью раствора анестетика (шаг 1.1).
   2. Положите крысу на грелку с температурой 37 °C и вытяжением полового члена, как описано в шаге 2.9.
   3. Запустите лазерный доплеровский перфузионный тепловизор (см. Таблицу материалов) для получения данных. Предварительно установите область интереса, которая будет считываться лазерным лучом.
   4. Нанесите противоседативный раствор (шаг 1.2), чтобы отменить анестезию.
   5. Используя программное обеспечение для анализа изображений, нарисуйте область интереса (ROI) вокруг области пениса и зарегистрируйте значения потока с течением времени.

6. Рентгенологическая оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение индукции стриктуры и разрешение стриктуры после уретропластики подтверждается ретроградной уретрограммой. Это обследование проводится через 1 неделю после индукции стриктуры (до уретропластики) и через 2 недели после уретропластики.

1. Выполняют ретроградную уретрограмму с помощью ангиографической системы monoplan (см. Таблицу материалов).
   1. Обезболивайте крыс с помощью раствора анестетика.
   2. Положите животное на матрас для ангиографии в правом косом пролежне с вытяжением полового члена, как описано в шаге 2.9.
   3. Сфокусируйте луч конуса на тазовой области животного, включая половой член.
   4. Поместите венозный катетер 22 G с шагом 2 мм в дистальный отдел мочеиспускательного канала.
   5. Начните закапывать в мочеиспускательный канал 1 мл йодного рентгеноконтрастного вещества (соотношение 1:1 раствора йопромида 623 мг/мл и 0,9% NaCl).
   6. Одновременно проведите простую рентгенографию, чтобы определить рентгеноконтрастное вещество, заполняющее просвет уретры, и оценить диаметр уретры.
   7. По завершении визуализации отмените анестезию с помощью противоседативного раствора.

7. Эвтаназия

ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия проводится через 3 недели после уретропластики (через 4 недели после индукции стриктуры), сразу после последней оценки перфузии.

1. Наполните шприц объемом 2,5 мл 2 мл/кг пентобарбитала натрия (400 мг/мл).
2. Выполняют внутрибрюшинную инъекцию раствора для эвтаназии животного.

Результаты

Всего для индукции стриктуры уретры использовали 12 крыс-самцов Wistar весом 400-500 г в возрасте 12-14 недель. Ретроградная уретрограмма (RUG1) была выполнена через 1 неделю⁸, что подтвердило успешность методики. Диаметр уретры измеряли в миллиметрах на уровне индукции стриктуры. После этого была выполнена уретропластика трансплантатом слизистой оболочки щеки на вентральной поверхности мочеиспускательного канала крысы. Этим же крысам через 14 дней после уретропластики была проведена вторая ретрог...

Обсуждение

Уретропластика с использованием трансплантатов слизистой оболочки щек является основным краеугольным камнем в реконструкции уретры. Тем не менее, для снижения осложнений и заболеваемости необходимо разработать инновационные процедуры, чтобы оптимизировать уже описанные и внедрить новые, такие как тканеинженерные материалы и биологические трансплантаты. Было опубликовано несколько процедур для создания доклинических моделей и определения хирургических методов. Souza et ^al.1 провели исследование с у...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Атипамезоле	OrionPharma		АНТИСЕДАН (атипамезол) предназначен для отмены седативного и обезболивающего эффекта.
Бупренорфин	RichterPharma		Бупренорфин — это производное опиоидного алкалоида тебаина, которое является более мощным (в 25–40 раз) и более длительное обезболивающее, чем морфин.
Хирургический стереомикроскоп Carl Zeiss Opmi-1 FC	Микроскопия Карла Цейса, Германия		OPMI 1 FC от ZEISS символизирует качество, точность и надёжность. Ручная система проста в использовании и обеспечивает высококачественные изображения с помощью легендарной оптики ZEISS.
Карпрофен	Зоетис		Карпрофен — это нестероидный противовоспалительный препарат (НПВС) класса пропионовой кислоты.
Катетер 22 G. x 1''	Б Браун	Безопасность интрокана	Внутривенный катетер фторированного этиленпропилена (FEP) с более прочной конструкцией для доступа к артериям .
Энрофлоксацин	Байер		Энрофлоксацин — это фторхинолоновый антибиотик.
Фентанил	Браун	3644960	Фентанил — мощный синтетический опиоидный анальгетик.
Флумазенил	Фрезениус Каби		Антагонист бензодиазепинов используется для полного или частичного обращения седативных эффектов, вызванных бензодиазепинами.
Коагуляция при высоких температурах	Fiab	F7244	Одноразовый коагулятор, стерильный, высокотемпературный (1200 и °; C), тонкий наконечник 28 мм.
Гель Instillagel	Farco-pharma		Смазка на основе целлюлозы с местными анестетиками и дезинфицирующими свойствами.
Иопромид	Байер		Неионная инъекционная контрастная среда с йодом.
Лазерная доплеровская система визуализации (перфузионный имиджер для LDI2-HIR и специализированное программное обеспечение)	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Аксминстер, Великобритания	5710	Модели ангиогенеза используют лазерную доплеровскую визуализацию для оценки перфузии кровообращения в задних конечностях, одна из которых хирургически связывается. Специализированное программное обеспечение для измерения и сравнения позволяет определять области интереса для оценки кровотока на ишемической и неишемической конечности, чтобы установить «коэффициент реперфузии», который можно оценивать столько, сколько потребуется, и в течение нескольких дней по одному и тому же объекту.
Глазной гель с лубриталом	Дехра		Глазной гель, используемый у животных для профилактики сухости глаз во время анестезии. Смазка и увлажняющее действие роговицы и конъюнктивы.
Самцы Wistar Han IGS (крысы Crl:WI(Han)	Лаборатории Чарльз-Ривер, Испания		От двенадцати до четырнадцати недель
Метедомидин	Вирбак	037/01/07RFVPT	Медетомидин — это синтетический препарат, используемый как хирургический анестетик.
Мидазолам	Лабесфаль		Бензодиазепины применяются для анестезии и процедурной седации.
Система монопланной ангиографии	Philips Medical Systems	Azurion 7 M20	Стационарная диагностическая флюороскопическая рентгеновская система, специально разработанная для оптимизации возможностей пользователей визуально и количественно оценивать анатомию и функцию кровеносных сосудов сердца, мозга и других органов, а также лимфатической системы.
Комарные щипцы	Генри Шайн	102-4346	Hartman-Mosquito Hemostatic Pinp, изогнутая 3-1/2" нержавеющая сталь
Держатель для иглы	Генри Шайн	100-2570	Держатель для игл Mayo-Hegar, нержавеющая сталь, 14 см
Футальмический держатель для иглы	Asico	AE-6143	Держатель для игл — самый тонкий без замка
Пентобарбитал натрий	Экуфар		Пентобарбитал натрий — это соль натрия в пентобарбитале, используемая для эвтаназии.
Заострённые щипцы	Эскулап	BD335R	Микропинцет, наконечник 0,30 мм
Polysorb 6.0	Medtronic (Covidien)	UL-101	Покрытый синтетический впитываемый шов был направлен на снижение воспалительной реакции в тканях, а затем постепенное инкапсулирование шва фиброзной соединительной тканью.
Провидон-йод	Mylan		Повидон-йод 10% — это антисептический препарат, используемый как дезинфицирующее средство до и после операции.
Клинок скальпеля nº 11	Б Браун	BB511	Углеродистая сталь, стерильная
Весенние ножницы	Генри Шайн	600-4826	Хирургические ножницы 31 castroviejo
Хирургические щипцы	Эскулап	BD33R	Микропинцет, наконечник 0,20 мм
Хирургические ножницы	Эскулап	MA873R	Micro Iris Scissor, изогнутые наконечники для шрапа
SurgiPro 7.0	Medtronic (Coviden)	VP-702-X	Неабсорбируемый монофиламентный полипропиленовый шов предназначен для общего применения в лигировании мягких тканей.