Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Защита клеток миокарда H9c2 от окислительного стресса кроцетином с помощью митофагии, опосредованной путем PINK1 / Parkin

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65105

⸱

26 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Основываясь на экспериментах in vitro , это исследование выявило механизм кроцетина в восстановлении окислительного стрессового повреждения кардиомиоцитов путем влияния на митофагию, в которой важную роль играет сигнальный путь PINK1 / Parkin.

Аннотация

Это исследование было направлено на изучение окислительного стресс-защитного эффекта кроцетина наH2O2-опосредованные клетки миокарда H9c2 с помощью экспериментов in vitro и дальнейшее изучение того, связан ли его механизм с воздействием митофагии. Это исследование также было направлено на демонстрацию терапевтического эффекта сафлоровой кислоты на окислительный стресс в кардиомиоцитах и изучение того, связан ли ее механизм с эффектом митофагии. Здесь была построена модель окислительного стресса на основе H 2 O2и оценена степень повреждения кардиомиоцитов окислительным стрессом путем определения уровней лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (CK), малонового диальдегида (MDA), супероксиддисмутазы (SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH Px). Для оценки повреждения митохондрий и апоптоза использовались флуоресцентные красители DCFH-DA, JC-1 и TUNEL, детектирующие активные формы кислорода (АФК). Аутофагический поток измеряли путем трансфицирования аденовируса Ad-mCherry-GFP-LC3B. Затем белки, связанные с митофагией, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. Однако кроцетин (0,1-10 мкМ) может значительно улучшить жизнеспособность клеток и уменьшить апоптоз и повреждение окислительным стрессом, вызванноеH2O2. В клетках с чрезмерной аутофагической активацией кроцетин также может уменьшать поток аутофагии и экспрессию связанных с митофагией белков PINK1 и Parkin, а также обращать вспять перенос паркина в митохондрии. Кроцетин может уменьшить H2O2-опосредованное окислительное стрессовое повреждение и апоптоз клеток H9c2, и его механизм был тесно связан с митофагией.

Введение

Острый инфаркт миокарда (ОИМ) представляет собой опасный для жизни некроз миокарда, вызванный тяжелой и стойкой ишемией и гипоксией коронарных артерий 1,2. Чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является одной из терапевтических стратегий первой линии при ОИМ и обычно защищает кардиомиоциты от ишемического повреждения 3,4. Дистальный отдел миокарда будет лишен кровоснабжения и снабжения кислородом, если его своевременно и эффективно не лечить после ОИМ, что приводит к ишемическому некрозу и дальнейшим сердечно-сосудистым осложнениям 5,6. Содействие восстановлению кардиомиоцитов и минимизация необратимого повреждения миокарда после упущения возможности хирургического вмешательства ЧКВ было горячей точкой исследований. После ОИМ кардиомиоциты находятся в состоянии ишемии и гипоксии, что приводит к ингибированию митохондриального окислительного фосфорилирования, восстановлению НАД+ до НАДФН и увеличению восстановления одиночных электронов7. В результате неполная реакция восстановления кислорода порождает избыток активных форм кислорода (АФК) и в конечном итоге приводит к повреждению кардиомиоцитов окислительным стрессом8. Чрезмерное накопление АФК вызывает перекисное окисление липидов, еще больше нарушая структуру и функцию митохондриальных мембран. Результатом является непрерывное открытие переходных пор митохондриальной проницаемости и снижение мембранного потенциала митохондрий, индуцируя апоптоз и некроз.

Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), блокаторы ангиотензин-рецепторов (БРА), ингибиторы β-адренорецепторов, антагонисты альдостерона и другие стандартные препараты при ОИМ могут помочь улучшить функцию сердца после инфаркта миокарда и предотвратить возникновение злокачественных событий, таких как аритмии и ремоделирование левого желудочка9. Однако на постинфарктную выживаемость и прогноз сильно влияют размеры инфаркта, и удовлетворительных результатов по снижению апоптоза кардиомиоцитов10,11 достигнуто не было. Таким образом, разработка препаратов, способствующих восстановлению кардиомиоцитов после инфаркта миокарда, стала актуальным вопросом.

Традиционная медицина уже много лет является источником вдохновения для современных фармацевтических исследований12,13,14,15. Традиционная китайская медицина (ТКМ) имеет долгую историю лечения ОИМ, и серия рандомизированных контрольных исследований в последние годы подтвердила, что ТКМ действительно может улучшить прогноз пациентов16,17. Согласно теории ТКМ, ОИМ вызывается застоем крови18,19, поэтому препараты для улучшения кровообращения обычно используются для лечения ОИМ в острой фазе20. Среди них считается, что шафран оказывает мощное влияние на активацию крови и застой и часто используется при остром лечении ОИМ. Кроцетин, основной компонент шафрана, может играть ключевую роль в защите кардиомиоцитов21.

В этом исследовании клетки миокарда H9c2 были индуцированыH2O2 для имитации ишемии / реперфузии миокарда, которая вызывает повреждение кардиомиоцитов ОИМ, а кроцетин использовался в качестве вмешательства для исследования его защитного эффекта против повреждения миокарда, вызванного окислительным стрессом. Механизм защиты кардиомиоцитов кроцетином был дополнительно изучен с помощью митофагии. Что еще более важно, эта статья дает ссылку на технический подход к изучению митофагии и подробно описывает всю экспериментальную процедуру.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились в лаборатории физиологии Пекинского университета китайской медицины, Китай. Все методы исследования были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами Пекинского университета.

1. Клеточная культура

  1. Добавьте 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в модифицированную среду Дульбекко Eagle (DMEM) (с 4,5 г / л D-глюкозы, 4,г/л L-глютамина и 110 мг / л пирувата натрия; см. Таблицу материалов) для получения полной среды DMEM.
  2. Разморозьте замороженные жидким азотом клетки миокарда H9c2 (см. Таблицу материалов) в теплой воде при температуре 37 °C с быстрым и равномерным перемешиванием до тех пор, пока лед не растает.
  3. Перенесите ячейки в центрифужную пробирку и добавьте в четыре раза больше объема полной среды DMEM. Центрифугу при 358 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  4. Полученную клеточную суспензию разбавить питательной средой, осторожно продуть и инокулировать клетки в колбу для культивирования. Культуру в инкубаторе при 37 °С с 5%СО2.

2. Определение жизнеспособности клеток

  1. Растворяют кроцетин (см. Таблицу материалов) в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентраций 0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ и 200 мМ.
  2. Диссоциируют клетки миокарда H9c2 трипсином, затем нейтрализуют смесь полной средой DMEM.
  3. Переложите клетки в центрифужную пробирку и центрифугу при 179 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и смешайте клетки в полной среде DMEM, осторожно продувая.
  4. Подсчитайте клетки с помощью планшета для подсчета клетоккрови 22 (см. Таблицу материалов) и разбавьте их до 5 × 104 клеток /мл с помощью полной среды DMEM.
  5. Разделите ячейки на девять равных частей. Добавьте ДМСО (разбавленный в соотношении 1:1000 с полной средой DMEM) в контрольную группу и добавьте различные концентрации кроцетина в остальные группы в соотношении 1:1000.
  6. Засейте клетки в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. Выбрасывают надосадочную жидкость после инкубации в течение 24 ч и трижды промывают клетки PBS.
  7. После добавления 100 мкл базальной среды DMEM инкубируют клетки в течение 4 ч и добавляют 20 мкл MTS (см. Таблицу материалов).
  8. Инкубируйте клетки еще 2 часа, измерьте поглощение на длине волны 490 нм и рассчитайте жизнеспособность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток = (обработанный OD - пустой OD) / (контроль OD - пустой OD) × 100.

3. Определение лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КФК), малонового диальдегида (МДА), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (GSH Px) и каталазы (КАТ)

  1. Засейте клетки H9c2 в 6-луночную пластину с плотностью 1 × 105 клеток. Соберите надосадочную жидкость после вмешательства и определите уровни ЛДГ и СОД в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Соберите надосадочную жидкость и промойте ее фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) один раз. Добавьте клеточный лизат в культуральную чашку и дайте ей постоять на льду в течение 20 минут. Соберите жидкость из чашки для культуры в центрифужную пробирку.
  3. Определяйте уровни CK, MDA, GSH-Px и CAT в соответствии с инструкциямипроизводителя 23 (см. Таблицу материалов и Дополнительный файл 1).
  4. Определите общую концентрацию белка лизиса методом бицинхониновой кислоты (BCA) для коррекции концентрации CK, MDA, GSH-Px и CAT24 (см. Таблицу материалов).

4. Определение АФК

  1. Засейте клетки H9c2 в 48-луночную пластину с плотностью 5 × 103 клеток. Разбавьте DCFH-DA (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1,000 со средой, не содержащей сыворотки. Выбросьте надосадочную жидкость клетки и дважды промойте клетку средой, не содержащей сыворотки.
  2. Добавьте 150 мкл разбавленного DCFH-DA в каждую лунку и инкубируйте при 37 ° C в течение 20 мин. Трижды промойте клетки средой, не содержащей сыворотки, и сделайте снимки под флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалов).

5. Определение мембранного потенциала митохондрий

  1. Определите потенциал митохондриальной мембраны с помощью набора для анализа потенциала митохондриальной мембраны JC-125 (см. Таблицу материалов). Выбросьте питательную среду и промойте ее один раз средством, не содержащим сыворотки.
  2. Добавьте рабочий раствор JC-1 в каждую пробирку и хорошо перемешайте. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин и дважды промыть клетки резервирующим буфером JC-1. Добавьте полную среду в каждую лунку и сделайте фотографии под флуоресцентным микроскопом.

6. Анализ окрашивания TUNEL

  1. Используйте набор для анализа апоптоза TUNEL (см. Таблицу материалов) для определения частоты апоптоза26. Выбросьте надосадочную жидкость и один раз промойте гранулы средой, не содержащей сыворотки.
  2. Добавьте раствор для фиксации клеток и промойте их PBS один раз после инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Добавьте в каждую лунку по 0,3% тритона-100 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Промойте клетки с помощью PBS дважды. Добавьте рабочий раствор TUNEL и выдерживайте при 37 °C в темноте в течение 60 минут.
  4. Добавьте антифлуоресцентную гашящую герметизирующую таблетку, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; см. Таблицу материалов), и сделайте фотографии под флуоресцентным микроскопом.

7. Мониторинг аутофагического потока путем трансфекции аденовируса mCherry GFP-LC3B

  1. Замените половину среды в каждой лунке свежей средой. Добавьте аденовирус Ad-mCherry GFP-LC3B (кратность инфекции [MOI] 2) в питательную среду и добавьте 5 мкг/мл полибрена (см. Таблицу материалов) для повышения эффективности инфекции.
  2. Замените свежую среду через 24 ч и наблюдайте за экспрессией флуоресцентного белка под конфокальным микроскопом.
  3. Культивируют клетки в тех же условиях, что и в секции 1, после подтверждения успешной вирусной инфекции и захватывают изображения под конфокальным микроскопом27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более 20% клеток показали флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP), что указывает на успешную инфекцию.

8. Вестерн-блоттинг

  1. Соберите клетки для экстракции цельного белка и лизируйте их (RIPA, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы = 100:1:1; см. Таблицу материалов) на льду в течение 30 мин.
  2. Добавьте 5-кратный буфер загрузки белка в образец белка после количественного определения белка и прокипятите образцы в течение 10 минут.
  3. Электрофорезные образцы, содержащие равные количества белка, с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле электрофореза (SDS-PAGE) гели28. Затем перенесите образцы на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
  4. Блокировать мембраны PVDF в течение 1 ч 5% сухим обезжиренным молоком и инкубировать с первичным антителом (PINK1, Parkin; см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение ночи и вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Обнаружение целевых полос с помощью раствора с усиленной хемилюминесценцией (ECL) и системы обнаружения хемилюминесценции. Используйте программное обеспечение Image J для количественной оценки полос с помощью денситометрии28.

9. Обнаружение митохондриальной транслокации Паркина методом иммунофлюоресценции

  1. Наблюдайте за колокализацией паркина с митохондриями путем двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Выбросьте надосадочную жидкость из каждой группы и промойте их три раза PBS.
  2. Зафиксируйте ячейки на 10 мин при комнатной температуре 4% параформальдегидом и добавьте 0,1% тритона-100 в PBS.
  3. Блокировать неживотным блочным раствором (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч для предотвращения неспецифического связывания между белками и антителами и снижения фона флуоресценции.
  4. Инкубировать с первичным антителом (Parkin и Tom20; см. Таблицу материалов) при 4 ° C в течение ночи.
  5. Добавить флуоресцентное вторичное антитело (см. Таблицу материалов) и выдержать в темноте в течение 1 ч.
  6. Добавьте DAPI-содержащие таблетки для тушения флуоресценции и сделайте снимки под конфокальным микроскопом.

10. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для построения графиков и анализа (см. Таблицу материалов).
  2. Сравните непрерывные переменные между группами, используя одностороннюю ANOVA. p < 0,05 считался статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Влияние кроцетина на жизнеспособность клеток
Кроцетин в концентрациях 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ оказывал значительное пролиферативное действие на клетки, в то время как кроцетин в концентрациях выше 200 мкМ значительно ингибировал пролиферацию клеток H9c2 (рис. 1A). После 4 ч лечения 400 мкМ H 2 O2жизнеспособность клеток значительно снижалась, и кроцетин мог в определенной степени обратить вспять это изменение (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследование эффективных ингредиентов из сложных соединений природных лекарств с помощью передовых технологий было горячей точкой исследований ТКМ29 и может предоставить лабораторные данные для будущей разработки лекарств после проверки. Сафлор является репрезентативным препаратом в лечении «улучшения кровообращения и минимизации застоя крови» и широко используется при лечении инфаркта миокарда30,31. Считается, что шафран обладает аналогич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было поддержано Пекинским фондом естественных наук (No 7202119) и Национальным фондом естественных наук Китая (No 82274380).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсинGibco2323363
1% пенициллин-стрептомицинSigmaV900929
5x белковый буфер для загрузки белкаBeijing Pulilai Gene TechnologyB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B аденовирусBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-конъюгированный козий анти-кроличий IgG (H+L) Чжуншань Голден Бридж Биотехнология Ко., Лтд.ZF-0514
Alexa Fluor 594-конъюгированный козий антимышиный IgG (H+L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Блокирующее раствор без животного происхожденияCST15019s
Антитело к паркинуSanta Cruzsc-32282
Антитело против PINK1ABclonalA11435
Антитело против TOM20ABclonalA19403
Антитело против &бета;-актина  антителоABclonalAC026
Набор для анализа белка BCAKeyGEN BiotechKGP902
Планшет для подсчета клеток кровиServicebioWG607
Наборы для анализа CATNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Система обнаружения хемилюминесценцииШанхайский завод научных приборов QinxiangChemiScope 6100
CK наборы для анализаNanjing Jiancheng Институт биоинженерииA032-1-1
Коэнзим Q10 (CoQ10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI-содержащие антифлуоресцентные гашащие таблеткиZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Gibco8122091
раствор с усиленной хемилюминесценцией (ECL)NCM BiotechP10100
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
ГрафПад Призма 7.0 Наборы
GSH-PxNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 клетки миокардаBeijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Пероксидаза хрена (HRP)-конъюгированная козья антикозлятника IgG (H+L) Чжуншань Голден Бридж Биотехнология Ко., Лтд.ZB-2305
Пероксидаза хрена (HRP)-конъюгированная козья антимышиная IgG (H+L) Чжуншань Голден Бридж Биотехнология Ко., Лтд.ZB-2301
JC-1 набор для анализа потенциала митохондриальной мембраныLABLEADJ22202
Наборы для анализа LDHНанкинский институт биоинженерии JianchengA020-2-2
MDAНанкинский институт биоинженерии JianchengA003-2-2
МетанолАладдинA2114057
MTS анализPromegaG3581
PerhydrlG-клонCS7730
Ингибитор фосфатазыCWBIOCW2383
PolybreneBeyotimeC0351
Мембраны из поливинилидендифторида (PVDF)MilliporeISEQ00010
Радиоиммунопреципитационный анализ (RIPA) лизис буферSolarbioR0010
SDS-PAGE гелиShanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE беговой буферный порошокServicebioG2018-1L
SDS-PAGE трансферный буферный порошокServicebioG2017-1L
SOD наборы для анализаNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Трис-буферный солевой порошокServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
набор для анализа апоптозаTUNEL BeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220
для анализа https://www.graphpad.com/

Ссылки

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079(2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002(2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748(2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749(2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515(2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394(2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010(2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473(2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032(2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837(2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253(2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271(2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462(2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Обработка кроцетиномрегуляция митофагиимитохондриальный мембранный потенциалактивные формы кислородааутофагический потоквестерн-блоттингконфокальная микроскопия
Защита клеток миокарда H9c2 от окислительного стресса кроцетином с помощью митофагии, опосредованной путем PINK1 / Parkin
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.