Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Триглицеридный липолиз в адипоцитах является важным метаболическим процессом, приводящим к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Здесь мы приводим подробный протокол измерения базального и стимулированного липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей.

Abstract

Адипоциты хранят энергию в виде триглицеридов в липидных каплях. Эта энергия может быть мобилизована посредством липолиза, где боковые цепи жирных кислот последовательно отщепляются от основной цепи глицерина, что приводит к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Из-за низкой экспрессии глицеринкиназы в белых адипоцитах скорость обратного захвата глицерина незначительна, в то время как обратный захват жирных кислот продиктован способностью связывания жирных кислот компонентов среды, таких как альбумин. Высвобождение глицерина и жирных кислот в среду может быть количественно определено с помощью колориметрических анализов для определения скорости липолитики. Измеряя эти факторы в несколько временных точек, можно с высокой достоверностью определить линейную скорость липолиза. Здесь мы приводим подробный протокол измерения липолиза в дифференцированных адипоцитах in vitro и жировой ткани ex vivo у мышей. Этот протокол также может быть оптимизирован для других клеточных линий преадипоцитов или жировой ткани других организмов; Обсуждаются соображения и параметры оптимизации. Этот протокол предназначен для определения и сравнения скорости липолиза адипоцитов между мышиными моделями и методами лечения.

Introduction

Избыток питательных веществ хранится в белой жировой ткани в виде триглицеридов в нейтральном липидном ядре липидных капель. Запасы триглицеридов мобилизуются посредством липолиза, процесса, при котором боковые цепи жирных кислот последовательно расщепляются триглицеридлипазой жировой ткани (ATGL), гормоночувствительной липазой (HSL) и моноглицеридлипазой (MGL), что приводит к высвобождению свободных жирных кислот (FFA) и глицериновой цепи ^1,2. Липолиз активируется передачей сигналов катехоламинов в жировой ткани. Симпатические нервные окончания локально высвобождают катехоламины, которые связываются с β-адренорецепторами на плазматической мембране адипоцитов. При связывании лиганда эти рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), активируют аденилатциклазу через G_αs. Последующая активация протеинкиназы А (PKA) цАМФ приводит к усилению регуляции как ATGL, так и HSL. Фосфорилирование перилипина-1 PKA вызывает диссоциацию ABHD5 (также известного как CGI-58), который связывает и коактивирует ATGL³. PKA непосредственно фосфорилирует HSL, способствуя его транслокации из цитозоля в липидную каплю, где взаимодействие с фосфорилированным перилипином-1 дополнительно способствует его липазной активности 4,5,6,7. Третья липаза, участвующая в липолизе, MGL, по-видимому, не регулируется передачей сигналов катехоламинов⁸. Важно отметить, что синтез триглицеридов в адипоцитах опосредован путем синтеза липидов глицерина, который не включает образование моноглицеридов в качестве промежуточного продукта; вместо этого глицерин-3-фосфатацилтрансферазы катализируют образование лизофосфатидной кислоты, которая соединяется с другим жирным ацил-КоА с образованием фосфатидной кислоты, а затем изомеризуется до диглицеридов до окончательного синтеза триглицеридов (рис. 1)9,10,11.

Рисунок 1: Пути синтеза липидов липолиза и глицерина. Вверху: Липолитический путь; ферменты, показанные красным цветом: триглицеридлипаза жировой ткани (ATGL), гормоночувствительная липаза (HSL) и моноглицеридлипаза (MGL). Внизу: путь синтеза липидов глицерина; ферменты, показанные зеленым цветом: диглицеридацилтрансфераза (DGAT), фосфатидная кислая фосфатаза (PAP), лизофосфатидная кислота ацилтрансфераза (LPAT, также известная как LPAAT) и глицерин-3-фосфат-ацилтрансфераза (GPAT). Липиды: триглицериды (ТГ), диглицериды (ДГ), моноглицериды (МГ), свободные жирные кислоты (СЖК), жирные ацил-КоА (ФА-КоА), лизофосфатидная кислота (ЛПА) и фосфатидная кислота (ПА). Другие метаболиты: неорганический фосфат (Pi) и глицерин-3-фосфат (G3P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Внеклеточный аденозин является еще одним важным регулятором липолиза, работая_{через Gs}– и G-i-связанные GPCR, чтобы влиять на активность аденилциклазы. Преобладающий аденозиновый рецептор в адипоцитах, ADORA1, ингибирует аденилатциклазу и, таким образом, липолиз посредством активации G_i¹². Экспрессируемый на более низких уровнях и в основном в коричневых адипоцитах, ADORA2A активирует липолиз через передачу^{сигналов G s 13}. ADORA1 влияет как на базальный липолиз, так и на реакцию на адренергические агонисты. Влияние аденозина на липолиз можно контролировать, добавляя аденозиндезаминазу для нейтрализации аденозина, а также ADORA1-специфический агонист фенилизопропиладенозин^14,15. Гормональная активация G_{q-связанных} GPCR также может влиять на липолиз через активацию фосфолипазы С и протеинкиназы С^16,17,18,19. Воспалительные сигналы также влияют на липолитические показатели. Активация TLR4 ЛПС (и другими эндотоксинами) увеличивает липолитическую скорость за счет активации ERK, который фосфорилирует перилипин-1 и HSL²⁰. TNF-α также активирует липолиз посредством активации ERK и NF-κB, а также транскрипционного подавления фосфодиэстеразы PDE-3B и CIDEC^21,22,23. IL-6 также был связан с повышенным липолизом адипоцитов, особенно в брыжеечной жировой ткани, высвобождение FFA которой влияет на стеатоз печени и глюконеогенез^24,25,26.

Липолиз подавляется во время вскормленного состояния инсулином. AKT фосфорилирует и активирует PDE-3B для подавления передачи сигналов цАМФ и предотвращения активации PKA²⁷. Инсулин также транскрипционно подавляет ATGL²⁸. Ожирение способствует резистентности к катехоламинам с помощью различных механизмов, включая подавление β-адренорецепторов в адипоцитах 29,30,31,32,33. Адипоциты экспрессируют все три β-адренорецептора (β-1, β-2 и β-3). В то время как адренорецепторы β-1 и β-2 экспрессируются повсеместно, адренорецептор β-3 преимущественно экспрессируется в адипоцитах у мышей^34,35. Экспрессия Adrb3 индуцируется C/EBPα во время адипогенеза³⁶. Адренорецептор β-3 высоко экспрессируется в зрелых адипоцитах. Активация адренорецепторов β-1 и β-2 является самоограничивающейся из-за ингибирования обратной связи β-аррестином³⁷. Ингибирование с обратной связью адренергического рецептора β-3 опосредовано другими сигнальными путями, которые снижают экспрессию Adrb3 ^33,38,39.

Многочисленные соединения могут быть использованы для активации липолиза адипоцитов. Катехоламины являются основными физиологическими активаторами липолиза. Норадреналин (или норадреналин) и адреналин (или адреналин) активируют все три β-адренорецептора⁴⁰. Норадреналин и адреналин также влияют на липолиз посредством активации передачи^{сигналов 41} α-адренергического рецептора. Обычно используемые агонисты β-адренорецепторов включают изопротеренол, который является неселективным агонистом β-адренорецепторов, и агонисты адренорецепторов β-3 CL-316,243 и мирабегрон⁴². Учитывая, что адипоциты преимущественно экспрессируют адренергический рецептор β-3, мы используем CL-316,243 в качестве примера. Его специфичность для адренорецептора β-3 также делает его относительно специфическим активатором передачи сигналов катехоламинов адипоцитов, который также можно безопасно использовать in vivo. Обратите внимание, что обычно используемая концентрация 10 мкМ CL-316,243 в культуре клеток на порядки выше, чем доза ~0,1 мкМ, необходимая для достижения максимального ответа³³. Форсколин обходит адренергический рецептор, непосредственно активируя аденилатциклазу и последующую липолитическую сигнализацию. Существует еще много активаторов, а также супрессоров липолиза. При выборе соединения для стимуляции липолиза в рамках экспериментального дизайна следует тщательно учитывать специфичность рецептора и последующие сигнальные пути.

Скорость липолиза в белой жировой ткани является важным метаболическим фактором, влияющим на переносимость холода и доступность питательных веществ во время голодания или физических упражнений^43,44,45,46. Целью этого протокола является измерение скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани, что облегчит понимание метаболизма адипоцитов и того, как он может влиять на метаболический фенотип различных мышиных моделей. Чтобы количественно оценить скорость липолитики, мы измеряем появление липолитических продуктов в средах (т.е. СЖК и глицерина). Метод основан на высвобождении липолитических продуктов из адипоцита в среду. Поскольку белые адипоциты экспрессируют низкие уровни глицеринкиназы, показатели обратного захвата глицерина низкие⁴⁷. И наоборот, следует также учитывать выработку СЖК и глицерина метаболическими путями, отличными от липолиза. Адипоциты, по-видимому, экспрессируют фосфатазу с активностью против фосфата глицерина-3, что позволяет производить глицерин из глицерин-3-фосфата, полученного из глюкозы^48,49,50. Гликолиз является источником глицерин-3-фосфата, используемого для повторной этерификации FFA в белых адипоцитах. Когда уровни глюкозы ограничены, глиценеогенез требует других 3-углеродных источников, таких как лактат и пируват⁵¹. Канализация FFA, высвобождаемых липолизом внутри клетки, и их метаболическая судьба плохо изучены; FFA, высвобождаемые липолизом, должны быть преобразованы в жирный ацил-КоА, прежде чем подвергаться повторной этерифицированности или β-окислению. Похоже, что СЖК, высвобождаемые липолизом, скорее всего, выходят из клетки, прежде чем возвращаться обратно и превращаться в жирный ацил-КоА 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . СЖК могут быть изолированы вне клетки альбумином. Важно отметить, что длинноцепочечные FFA, как известно, ингибируют липолиз с обратной связью, если они не секвестрированы альбумином 63,64,65,66,67. Таким образом, оптимизация буферной емкости среды FFA во время анализа липолиза имеет решающее значение. Описанная здесь процедура аналогична ранее опубликованным методам измерения скорости липолитиков в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей и людей 15,68,69,70,71. Этот протокол отличается использованием последовательной выборки; Выполняя последовательный отбор проб, мы можем внутренне подтвердить, что липолиз измеряется в линейной фазе, и использовать несколько измерений для расчета скорости липолиза, тем самым уменьшая погрешность измерения и повышая достоверность конечного расчетного значения. Недостатком серийного отбора проб является то, что анализ требует больше времени и реагентов; Однако более длительный срок снижает влияние погрешности измерения на стандартную погрешность оценок ставки. Кроме того, в этом протоколе измеряется высвобождение как СЖК, так и глицерина и рассматривается соотношение высвобождения СЖК и глицерина с целью достижения соотношения 3:1, как и следовало ожидать от полного липолиза и высвобождения липолитических продуктов в среду⁷².

Protocol

Использование всех животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Вейля Корнелла Корнельского университета.

1. Подготовка буферов и сборных пластин

1. Сделайте 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), растворив 5 г BSA в 100 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle’s Medium (DMEM) без фенольного красного. Аккуратно перемешайте BSA до растворения (встряхивание контрпродуктивно). Как только BSA полностью растворится, фильтруйте фильтр и стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм. Храните носитель BSA при температуре 4 °C до 1 месяца.
2. Сделайте рабочие концентрации контрольных и стимулирующих сред. Управляющая среда: 5% среды BSA с управлением транспортным средством. Среда стимуляции: 5% среды BSA с 0,5 мкМ CL-316,243. Для каждого эксперимента приготовьте свежие среды для стимуляции.
3. Нагрейте используемый носитель до 37 °C. Наклейте этикетку на 96-луночную пластину для сбора носителей.

2. Пробоподготовка

1. Выполните культивирование клеток, как описано ниже. Выполняйте все работы с ячейками в стерильном вытяжном шкафу, чтобы свести к минимуму внешнее загрязнение.
   1. Выделяют и дифференцируют первичные преадипоциты, как в^73,74.
      1. Пластинчатые первичные преадипоциты с высокой плотностью, такие как 1 x 10⁵ клеток / лунка в 24-луночном планшете в 1 мл / лунка культуральная среда (15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин в DMEM / F12).
      2. После того, как клетки достигнут 100% слияния, дифференцируют с 5 мкМ дексаметазоном, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантином, 1 мкг/мл инсулина и 1 мкМ тиазолидиндионом (TZD) в питательных средах в течение 3 дней. Затем перейдите на питательную среду с инсулином 1 мкг / мл в течение не менее 3 дней, чтобы вырастить липидные капли. Используйте 1 мл/лунку среды в 24-луночной пластине.
      3. Меняйте питательные среды (1 мл/лунка) инсулином каждые 2 или 3 дня. Клетки могут поддерживаться в среде с инсулином до 2 недель. Для этого анализа используйте только культуры, в которых показатели дифференцировки превышают 90% и одинаковы в разных группах, так как снижение дифференцировки может быть неверно истолковано как снижение скорости липолитики.
      4. Культивируют клетки в безинсулиновых средах в течение 24 ч перед измерением липолиза.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин в среде поддерживает липидные капли, но также ингибирует липолиз. Инкубация без инсулина в течение 24 ч позволяет провести полную липолитическую активацию без потери объема липидных капель. В некоторых системах может потребоваться сокращение или продление времени культивирования без инсулина.
   2. Промойте клетки DPBS один раз, чтобы удалить остатки сыворотки из питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не включает сывороточное голодание, которое может активировать липолиз. Сывороточное голодание может быть использовано по усмотрению исследователя.
2. Выполните культуру ex vivo, как описано ниже.
   1. Подготовьте 6-луночную тарелку с одной лункой для каждой ткани, которая будет собрана у каждой мыши. Поместите 4 мл DMEM комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA в средствах сбора не требуется.
   2. Подготовьте 48-луночную пластину для анализа липолиза, по одной лунке для каждой реплики. Поместите 400 мкл ДМЭМ комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться. Используйте две-четыре контрольных и две-четыре стимулированных лунки на ткань на мышь.
   3. Усыпить мышь вывихом шейки матки под наркозом, вторичным методом, таким как двусторонний пневмоторакс. Здесь мы использовали 32-граммовую 7-месячную самку мыши C57BL / 6J, которую кормили 45% диетой с высоким содержанием жиров в течение 4 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также может быть использован для мужчин, а также для других штаммов, диет и возрастов.
   4. Сбрызните 70% этанолом и с помощью ножниц сделайте небольшой (~ 1 см) боковой разрез в центре кожи живота, раздвиньте кожу, ущипнув обе стороны большим и указательным пальцами, и сложите нижнюю часть живота, чтобы обнажить задние подкожные депо. Найдите и удалите паховый лимфатический узел и затупите паховую жировую ткань непосредственно позади пахового лимфатического узла с помощью щипцов.
   5. Чтобы собрать гонадную жировую ткань, сделайте боковой и вертикальный разрез в брюшине, чтобы получить доступ к брюшной полости. Держите жировую подушку гонад пинцетом и разрежьте вдоль матки (или придатка яичка для мужчин), чтобы удалить жировую ткань гонады. Поместите собранные склады в 6-луночную тарелку.
   6. Снимите салфетку с лунки, положите на силиконовый коврик и нарежьте ножницами на кусочки по 5-7 мг.
   7. Взвесьте от 25 до 30 мг (пять или шесть кусков) для каждой пробирной лунки и поместите в пробирную пластину на 48 лунок. Промокните салфетку на чистом полотенце перед взвешиванием, чтобы удалить все носители. Взвесьте весовую лодку после удаления ткани и запишите вес любых оставшихся остатков. Протрите весовую лодку между образцами и при необходимости снова тарируйте. Используйте новую весовую лодку для каждой ткани.
   8. После того, как все образцы тканей будут взвешены, поместите 48-луночную тестовую пластину в инкубатор с 37 °C, 10% CO₂ на 15 минут.

3. Анализ на липолиз

1. Выполните сбор мультимедиа. Проведите перенос среды и последующий отбор проб в стерильный вытяжной шкаф, чтобы свести к минимуму потенциальное загрязнение из внешних источников.
   1. При t = 0 удалите среду и добавьте 400 мкл на лунку контрольной или стимулирующей среды, а затем поместите планшет для анализа в инкубатор с 37 °C и 10% CO₂ . Для культивирования тканей ex vivo осторожно удалите среду с помощью пипетки; Ни в коем случае нельзя использовать всасывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы подготовьте вторую пластину со средой для контроля и стимуляции и перенесите ткани.
   2. При t = 1, 2, 3 и 4 ч соберите 200 мкл среды, замените ее 200 мкл соответствующей контрольной или стимулирующей среды и верните пробирную пластину в инкубатор. Храните сборную пластину при температуре 4 °C. Чтобы определить буферную емкость среды BSA FFA, используйте дополнительный сбор через 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом эксперименты можно остановить, а собранные носители можно хранить при -20 °C.

4. Колориметрический анализ FFA

1. Нагрейте реагенты до комнатной температуры и растворите один флакон цветного реагента А с одним флаконом растворителя А, а один флакон с цветным реагентом В с одним флаконом растворителя В. С момента восстановления эти реагенты лучше всего использовать в течение 1 недели. Выбросить через 1 месяц после восстановления.
2. Разморозьте и перемешайте образцы.
3. Создайте стандартную кривую FFA. Стандартный раствор составляет 1 мМ. Используйте следующий объем с реагентами для стандартной кривой: 25 мкл, 20 мкл, 15 мкл, 10 мкл, 10 мкл (разведение 1:2), 10 мкл (разбавление 1:4), 10 мкл (разбавление 1:8) и 10 мкл воды для максимального диапазона. Для низких уровней FFA могут быть более применимыми 10 мкл стандарта 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0,05 мМ.
4. Стандарты пипетки и образцы в 96-луночную пробирную пластину. Рекомендуемый объем образца составляет 10 мкл. Включите три лунки с тем же объемом среды BSA, что и образцы для коррекции фона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрации в пробе выходят за пределы диапазона стандартной кривой, повторите анализ, отрегулировав объем образца до 2-25 мкл.
5. Добавьте по 150 мкл реагента А в каждую лунку и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
6. Считайте коэффициент поглощения пластины при 550 нм и 660 нм эталона (чтение A).
7. Добавьте 75 мкл реагента B в каждую лунку и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
8. Еще раз считайте коэффициент поглощения пластины при 550 нм и 660 нм (чтение B).

5. Колориметрический анализ глицерина

1. Восстановите свободный глицериновый реагент 36 мл сверхчистой воды и акклиматизируйте до комнатной температуры. Эти реагенты лучше всего использовать в течение нескольких недель. Выбросить через 2 месяца после восстановления.
2. Разморозьте и перемешайте образцы.
3. Создайте стандартную кривую глицерина, сделав семиточечное, 2-кратное последовательное разведение стандартного раствора глицерина и пустую воду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая является относительно линейной до 25 мкл глицерина 2,8 мМ, но не линейной при более высоких концентрациях.
4. Пипетка по 25 мкл каждого стандарта и образцов в 96-луночную пробирную пластину. Включите три лунки со средой BSA для коррекции фона.
5. Добавьте в каждую лунку по 175 мкл свободного глицеринового реагента и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
6. Считайте поглощение пластины на длине волны 540 нм.

6. Расчет липолитического курса

1. Начните со значений оптической плотности (OD). Для глицерина используйте значения OD_{A 540} напрямую. Рассчитайте OD анализа FFA по следующей формуле:
   OD = (Чтение B: A 550 – A 660) – (Чтение A: A₅₅₀ – A₆₆₀)
2. Используйте стандартную кривую для расчета уровней СЖК и глицерина в собранных образцах. Нанесите стандартные значения OD на ось y, а на ось x используйте стандартные концентрации относительно объема образца (т. е. концентрация лунок с 20 мкл стандарта FFA 1 мМ на пластине с образцами 10 мкл равна 2 мМ). Подгонка линейной линии тренда:
   y = mx + b
3. Визуально осмотрите стандартную кривую и удалите все точки за пределами линейного диапазона анализа. Рассчитайте концентрацию пробы, используя уравнение:
   Концентрация образца: x = (OD – b) ÷ м
4. Корректируйте и повторно анализируйте образцы, выходящие за пределы линейного диапазона анализа. Чтобы получить окончательную концентрацию пробы, вычтите из концентрации проб концентрацию фоновых скважин, содержащих только среду BSA.
5. Рассчитайте моли FFA и глицерина, продуцируемые каждым образцом в каждый момент времени, по формуле:
   
   где C n = концентрация в момент времени t = n; V_t = общий объем в скважине; V_s = объем отбора проб; и M n = моли, образующиеся в момент времени t = _n (когда концентрации указаны в мМ, а объемы – в мл, на выходе получается мкмоль).
   Например, в разные моменты времени:
   M 1 = C₁ × V_t
   М 4 = С₄ × В _t + (С₁ + С 2+ С₃)В _с
   или
   М 4 = С₄ × В_т + С₃ × В_с + С₂ × В с + С_{1 ×В с}
6. Нормализуйте массу ткани путем деления на массу ткани для каждого образца в граммах, чтобы получить единицы мкмоль/г. Для культивируемых клеток значения представлены в мкмоль/лунка. Убедитесь, что количество клеток и эффективность дифференцировки сопоставимы от скважины к скважине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различия в эффективности пролиферации или дифференцировки усложнят интерпретацию результатов и потребуют другого метода нормализации (например, нормализации до белка; см. обсуждение).
7. Рассчитайте наклон полученного мкмоль/г (ось y) в зависимости от времени (ось x) для каждого образца в отдельности.
   1. В электронной таблице это можно сделать с помощью функции =SLOPE(known_ys,known_xs). В новой ячейке введите «=НАКЛОН» (затем с помощью курсора выделите образцы значений глицерина или FFA в мкмоль/г, а затем выделите соответствующие значения времени).
   2. Проверьте линейность данных. Значения R² являются быстрым способом определения линейности образцов. В электронной таблице это можно сделать с помощью функции =RSQ(known_ys,known_xs) так же, как описано в шаге 6.7.1, но начальные входные данные =RSQ. Убедитесь, что значения R² > 0,98; Меньшие значения указывают на отклонение от линейности. Это может быть результатом ошибки измерения/выборки или потери линейности.
      1. Другой способ проверить линейность — выполнить линейную регрессию для каждого образца и построить график остатков. В программном обеспечении для статистического анализа создайте таблицу XY с одним значением Y для каждого момента времени. Выберите «Анализ» > «Простая линейная регрессия» и установите флажок « Остаточный график », прежде чем нажать кнопку «ОК». Остаточный график появится в виде нового графика.
8. Используйте скорость производства FFA и глицерина (т. е. наклон [(мкмоль/г/ч]) для каждого образца в качестве отдельной точки данных для выполнения статистического анализа и построения графика значений, если сравниваются различные липолитические условия. Если липолитические показатели сравниваются между генотипами, используйте два или три образца на животное в качестве технических реплик и используйте среднее значение для одной точки данных на животное, чтобы размер выборки был равен количеству животных.

Representative Results

Discussion

Здесь мы приводим базовый протокол для измерения скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo . Для количественной оценки липолиза важно измерить скорость липолитики в линейной фазе. Мы используем метод серийного отбора проб, при котором большая часть среды собирается и заменяется свежей средой через равные промежутки времени. Этот полуконсервативный метод позволяет добавлять свежий BSA с буферной способностью FFA и задерживает ингибирование обратной связи, увеличивая продолжительность линейного липолиза. В этом экспериментальном дизайне предпринята попытка повторить васкуляризацию жировой ткани in vivo, которая доставляет свежий альбумин для связывания высвобожденных FFAs⁷⁵. Этот протокол был оптимизирован для измерения липолиза в мышиной белой жировой ткани ex vivo и паховой жировой ткани, первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro. Протокол, вероятно, может быть оптимизирован для работы с коричневыми и бежевыми жировыми депо, а также с жировой тканью других организмов и иммортализированными клеточными линиями с высоким адипогенным потенциалом. Протокол допускает гибкость в отношении возраста, пола и диеты мышей до сбора жировой ткани для анализов ex vivo . Некоторые манипуляции, такие как голодание, могут влиять на базальную липолитическую скорость, в то время как другие вмешательства, такие как ожирение, вызванное диетой, также влияют на скорость стимулированного липолиза.

Протокол должен быть оптимизирован для каждой экспериментальной системы, в зависимости от того, выше или ниже липолитические показатели. Чтобы проверить линейность, мы рекомендуем вычислить значения R² и посмотреть на график остатков. Значения R² должны быть очень близки к 1. При оценке остаточного графика следует обращать внимание на отрицательные остаточные значения в более поздние моменты времени, поскольку они указывают на то, что липолитические показатели снижаются, а линейность теряется. Примеры таких остаточных участков показаны на рисунке 5E,F. Исключение 4-часовых временных точек в этом случае обеспечивает более точный расчет линейной липолитической скорости и улучшает значения R². Однако, поскольку скорость рассчитывается из нескольких временных точек, она относительно надежна, и включение такой временной точки оказывает лишь небольшое влияние на значения R² и расчетную скорость липолиза. Если для расчета липолитической скорости используется один момент времени, данные могут быть легко искажены.

Способ нормализации данных также может повлиять на относительные результаты между выборками. Здесь мы рекомендуем нормализовать ткань ex vivo к массе ткани и первичным преадипоцитам, дифференцированным in vitro на лунку. Однако эти методы нормализации могут не подходить для всех экспериментальных систем. Важно отметить, что если скорость пролиферации или эффективность дифференциации различаются между группами, нормализация для каждой скважины нецелесообразна. Альтернативные методы нормализации включают белок, липид и ДНК. Каждый метод нормализации имеет свои преимущества и недостатки. Нормализация массы тканей проста и понятна. Различия в размере адипоцитов могут означать, что мышечная жировая ткань содержит гораздо больше адипоцитов на грамм, чем жировая ткань с ожирением, в то время как различия в эффективности дифференцировки могут привести к различиям в количестве адипоцитов в лунке. Липиды могут быть экстрагированы с помощью органических растворителей (например, хлороформа: метанола [v/v] 2:1) и содержания триглицеридов, измеренного с использованием колориметрического реагента. Хотя нормализация содержания липидов не является традиционно используемым методом, липидные капли, в конце концов, являются органеллой, подвергающейся липолизу, и этот метод нормализации специфичен для адипоцитов, что может быть полезно, когда скорость дифференцировки различается между клетками. После экстракции липидов 0,1-0,3 N NaOH можно использовать для извлечения белка, который затем может быть проанализирован с помощью анализа белка Брэдфорда или BCA⁶⁸. Альтернативно, образцы могут быть гомогенизированы в лизисном буфере, а липидная фракция удалена центрифугированием⁷⁰. Обратите внимание, что загрязнение липидами будет мешать анализу белка. Если белок должен быть использован для нормализации, клетки должны быть тщательно промыты (не менее трех раз), чтобы удалить BSA из анализируемой среды. Иногда дифференцированные адипоциты плохо прилипают к пластине и не переносят три промывки, необходимые для удаления избытка BSA. Нормализация к ДНК позволяет нормализовать количество клеток и может быть выполнена с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК с последующей количественной оценкой общей ДНК путем абсорбции или ПЦР-анализа числа копий генов в реальном времени. В качестве альтернативы, в клетках с покрытием окрашивание DAPI с последующей визуализацией может быть использовано для подсчета ядер и нормализации до количества клеток. При нормализации с использованием количества клеток или белка важно учитывать неадипоцитарные клетки в образце. Жировая ткань также содержит иммунные и эндотелиальные клетки; При ожирении жировой ткани воспаление и гипертрофия могут привести к тому, что только 1 из 10 ядер происходит из зрелых адипоцитов. Тем не менее, адипоциты по-прежнему вносят свой вклад в большую часть массы и содержания липидов в ткани. Для дифференцированных преадипоцитов in vitro эффективность дифференцировки влияет на относительный процент зрелых адипоцитов; В этом случае нормализация усложняется. В идеале эффективность дифференцировки должна быть оптимизирована перед использованием клеток для анализа липолиза. Если это невозможно, рекомендуется нормализация содержания липидов, если объем липидных капель одинаков между дифференцированными адипоцитами. Сравнение липолитических показателей в культурах адипоцитов с неодинаковой дифференцировкой может привести к ошибочным выводам о липолизе, когда движущим фактором на самом деле является адипогенез; Это ограничение протокола.

Длинноцепочечные СЖК ингибируют липолиз^с обратной связью 63,64,65,66,67. FFA накапливаются, когда они недостаточно изолированы в средствах массовой информации. Большая часть устранения неполадок, связанных с оптимизацией измерения липолиза, связана с минимизацией удержания FFA. Расчет молярного отношения высвобождения FFA:глицерина в среду помогает выявить проблемы, связанные с удержанием FFA. Если молярное соотношение составляет 3:1 для FFA:глицерин, то все продукты липолиза высвобождаются и улавливаются в средах, в то время как соотношение ниже 2:1 является поводом для беспокойства. Важным фактором для анализов ex vivo является размер куска жировой ткани. Более крупные куски ткани имеют более низкое отношение площади поверхности к объему и, таким образом, с большей вероятностью сохраняют СЖК и, как следствие, демонстрируют пониженные липолитические показатели (рис. 4A, B). Помня об этом, очень важно разрезать жировую ткань для каждого образца на куски одинакового размера и формы. Чтобы облегчить секвестрацию FFA в средствах массовой информации, также важно убедиться, что среда содержит достаточное количество BSA для связывания высвобожденного FFA. Буферная емкость среды FFA может быть увеличена за счет увеличения концентрации BSA или увеличения объема среды. Не менее эффективно увеличивать объем или частоту сбора. Если наблюдаются высокие липолитические показатели, но соотношение FFA:глицерин ниже 2:1, мы рекомендуем увеличить частоту сбора до каждых 30 минут и прекратить анализ через 2,5 часа.

Представленный здесь протокол оптимизирован для белой жировой ткани мыши ex vivo и первичных преадипоцитов, дифференцированных in vitro, оба из которых являются высоколиполитическими. Анализ должен быть оптимизирован для измерения липолиза в других системах или если различия в относительно низкой базальной скорости липолиза представляют особый интерес. Например, адипоциты 3T3-L1 обладают более низкой липолитической активностью³². Когда скорость липолитики низкая, инкубационный объем следует уменьшить (т. е. вместо 400 мкл на лунку в 24-луночном планшете следует использовать 200 мкл в 24-луночном планшете или 300 мкл в 12-луночном планшете и 100-150 мкл собранного за определенный момент времени). Объем сбора не должен опускаться ниже 100 мкл, так как для точного измерения низких уровней СЖК и глицерина требуются большие объемы образцов. Для анализа глицерина с использованием 50 мкл среды на пробу свободный глицериновый реагент следует растворить в 31 мл воды, а 150 мкл реагента использовать с 50 мкл образца в каждой лунке. Уровни FFA могут быть измерены с 25 мкл образца на скважину, возможно, больше, при условии сохранения линейности. Временные точки также могут быть расширены для увеличения сигнала. При анализе липолитических показателей из клеток, отличных от белых адипоцитов, следует учитывать различия в клеточном метаболизме. Например, коричневые и бежевые адипоциты экспрессируют гораздо более высокие уровни глицеринкиназы и, таким образом, способны удерживать высвобождение глицерина путем липолиза^76,77. Эти метаболически активные клетки также могут направлять высвобожденные жирные кислоты в катаболические или синтетические пути без высвобождения в среду. Метаболическая судьба СЖК и глицерина в конкретном анализируемом типе клеток должна учитываться при интерпретации результатов анализа липолиза, особенно в типе клеток, отличном от белых адипоцитов. Анализы липолиза в других типах клеток должны быть оптимизированы и проверены.

Этот протокол предназначен для оценки различий в скорости липолитиков на мышиных моделях. Первичные преадипоциты, дифференцированные in vitro , являются полезным инструментом для исследования клеточных автономных эффектов генетических манипуляций или фармакологических методов лечения адипоцитов. Жировая ткань, с другой стороны, содержит другие типы клеток, включая иммунные клетки. Влияние иммунных клеток жировой ткани на регуляцию липолиза важно учитывать при оценке липолиза всей ткани. Культивируемые модели липолиза адипоцитов могут обойти потенциальное осложняющее влияние иммунных клеток и обеспечить тщательное исследование конкретных типов клеток, в то время как эксплантаты жировой ткани позволяют проводить более надежное сравнение со средой in vivo . Кроме того, анализ ex vivo может быть использован для исследования липолитических показателей в различных жировых депо. В этих системах липолиз стимулируется такими соединениями, как агонисты β-адренорецепторов, таким образом, любые изменения симпатического тонуса, которые могут повлиять на мышиную модель in vivo , не будут наблюдаться. Измерение липолиза in vivo осложняется динамикой высвобождения и поглощения СЖК и глицерина различными тканями по всему организму. Уровни СЖК и глицерина в сыворотке крови в любой момент времени представляют собой баланс секреции и поглощения, и не следует предполагать, что изменения уровня СЖК и глицерина в сыворотке крови связаны исключительно с липолизом жировой ткани. На липолиз, вызванный голоданием, влияет симпатический тонус, но он не вызывает быстрых и устойчивых изменений уровня СЖК или глицерина в сыворотке крови, что затрудняет интерпретацию изменений уровней СЖК и глицерина в сыворотке натощак. Липолиз in vivo можно стимулировать с помощью агониста адренорецепторов β-3, такого как CL-316,243, а повышенный уровень СЖК и глицерина в сыворотке крови обнаруживается в течение 20 минут после стимуляции. Липолитические анализы in vivo должны включать как исходные измерения сывороточного СЖК и глицерина, так и контроль носителя; таким образом, можно определить специфическое для стимуляции изменение уровня СЖК и глицерина в сыворотке.

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc, 	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793 	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A 	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B 	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x 	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work