Триглицеридный липолиз в адипоцитах является важным метаболическим процессом, приводящим к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Здесь мы приводим подробный протокол измерения базального и стимулированного липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение скорости липолиза в мышиной жировой ткани ex vivo и первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Адипоциты хранят энергию в виде триглицеридов в липидных каплях. Эта энергия может быть мобилизована посредством липолиза, где боковые цепи жирных кислот последовательно отщепляются от основной цепи глицерина, что приводит к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Из-за низкой экспрессии глицеринкиназы в белых адипоцитах скорость обратного захвата глицерина незначительна, в то время как обратный захват жирных кислот продиктован способностью связывания жирных кислот компонентов среды, таких как альбумин. Высвобождение глицерина и жирных кислот в среду может быть количественно определено с помощью колориметрических анализов для определения скорости липолитики. Измеряя эти факторы в несколько временных точек, можно с высокой достоверностью определить линейную скорость липолиза. Здесь мы приводим подробный протокол измерения липолиза в дифференцированных адипоцитах in vitro и жировой ткани ex vivo у мышей. Этот протокол также может быть оптимизирован для других клеточных линий преадипоцитов или жировой ткани других организмов; Обсуждаются соображения и параметры оптимизации. Этот протокол предназначен для определения и сравнения скорости липолиза адипоцитов между мышиными моделями и методами лечения.
Введение
Избыток питательных веществ хранится в белой жировой ткани в виде триглицеридов в нейтральном липидном ядре липидных капель. Запасы триглицеридов мобилизуются посредством липолиза, процесса, при котором боковые цепи жирных кислот последовательно расщепляются триглицеридлипазой жировой ткани (ATGL), гормоночувствительной липазой (HSL) и моноглицеридлипазой (MGL), что приводит к высвобождению свободных жирных кислот (FFA) и глицериновой цепи 1,2. Липолиз активируется передачей сигналов катехоламинов в жировой ткани. Симпатические нервные окончания локально высвобождают катехоламины, которые связываются ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование всех животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Вейля Корнелла Корнельского университета.
1. Подготовка буферов и сборных пластин
- Сделайте 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), растворив 5 г BSA в 100 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) без фенольного красного. Аккуратно перемешайте BSA до растворения (встряхивание контрпродуктивно). Как только BSA полностью растворится, фильтруйте фильтр и стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм. Храните носитель BSA при температуре 4 °C до 1 месяца.
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы измерили базальную и стимулированную липолитическую скорость дифференцированных адипоцитов in vitro. Первичные преадипоциты из паховой белой жировой ткани дифференцировали в адипоциты путем обработки сливающихся клеток 5 мкМ дексаметазоном, 0,5 мМ IBMX, 1 мкг/мл инсулина и 1 мкМ троглитазоном в течение 4 дней с последующим дополнительным 3-дневным лечением инсулином 1 мкг/мл. Клетки инкубировали в средах без инсулина в течение 24 ч до анализа липолиза. В момент времени = 0 ч, клетки промывали один раз PBS, за.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы приводим базовый протокол для измерения скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo . Для количественной оценки липолиза важно измерить скорость липолитики в линейной фазе. Мы используем метод серийного отбора проб, при котором большая часть среды собирается и заменяется свежей средой через равные промежутки времени. Этот полуконсервативный метод позволяет добавлять свежий BSA с буферной способностью FFA и задерживает ингибирование обратной связи, увеличивая продолжительность линейного липоли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения США R01DK126944 для S.M.R.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 24-луночная тканевая культура обработанная пластина | Corning Inc | 3527 | Необходимо обрабатывать культуру тканей для дифференциации адипоцитов |
| 48-луночная плоская нижняя пластина с крышкой | Corning Inc | 353078 | Может быть обработана культурой ткани |
| 6-Луночная плоская нижняя пластина с крышкой | Corning Inc | 353046 | Может быть обработана тканевой культурой |
| 96-луночная ПЦР-пластина | США sceintific | 1402-9100 | Любой конический 0,2 мл ПЦР-планшет будет удобным |
| бычья сыворотка альбумин | Sigma Aldrich | A9418 | FFA без BSA, такая как A8806. BSA не должен иметь обнаруживаемого FFA, также вариации BSA могут влиять на наблюдаемую скорость липолиза |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 доступно у других поставщиков |
| CO2 инкубатор | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 в идеале должен быть установлен на 10% для жировой ткани, однако 5% CO2 также будет работать |
| DMEM, низкий уровень глюкозы, отсутствие фенола красного | Thermofischer | 11054020 | Любая среда без фенола красного цвета должна работать, DMEM/F12, RPMI, но должна содержать летучую буферную способность, т.е. биокарбонат |
| не содержащий FFA бычий сывороточный альбумин | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Реагент свободного глицерина | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Стандартный раствор глицерина | Sigma Aldrich | G7793 | Это также можно сделать, разбавив глицерин до нужной концентрации |
| Стандартный раствор серии HR NEFA | Fujifilm | 276-76491 | |
| HR Серия NEFA-HR (2) Цветной реагент A | Fujifilm | 999-34691 | |
| HR Серия NEFA-HR (2) Цветной реагент B | Fujifilm | 991-34891 | |
| HR Серия NEFA-HR (2) Растворитель A | Fujifilm | 995-34791 | |
| HR серия NEFA-HR (2) Растворитель B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Микробиологический инкубатор | Fischer Scientific | S28668 | Любой инкубатор при температуре 37C можно использовать |
| Nunc MicroWell 96-Well Plates | Thermo Scientific | 269620 | Любой оптически прозрачный, плоскодонный 96-луночный планшет также |
| силиконовый лабораторный настольный коврик | VWR | 76045-300 | Стеклянная пластина. Не рекомендуется использовать абсорбирующие поверхности |
| Спектрофотометр/Микропланшет Считыватель | молекулярных приборов | SpectraMax i3x | Подойдет любой считыватель пластин, который может считывать на 540, 550 и 660 мм |
| V Бычья сыворотка альбумин | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Wipers | Kimberly-Clark | 41200 | Подойдет любое качественное бумажное полотенце |
Ссылки
- Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
- Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tiss....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
