Методическая статья

Ферритинофагия: оценка селективной деградации железа путем аутофагии в фибробластах человека

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

23 февраля 2024 г.

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит подробные инструкции по проведению высокопроизводительной иммунофлуоресцентной оценки ферритинофагии в первичных фибробластах человека, полученных из кожи.

Аннотация

Мутации в гене аутофагии WDR45/WIPI4 являются причиной бета-пропеллер-ассоциированной нейродегенерации (BPAN), подтипа заболеваний человека, известного как нейродегенерация с накоплением железа в мозге (NBIA) из-за наличия отложений железа в мозге пациентов. Внутриклеточный уровень железа жестко регулируется рядом клеточных механизмов, в том числе критическим механизмом ферритинофагии. В этой статье описывается, как можно оценить ферритинофагию в первичных фибробластах человека, полученных из кожи. В этом протоколе мы используем железомодулирующие условия для индукции или ингибирования ферритинофагии на клеточном уровне, такие как введение бафиломицина А1 для ингибирования функции лизосом и лечение цитратом железа аммония (FAC) или деферазиоксом (DFX) для перегрузки или истощения железа соответственно. Такие обработанные фибробласты затем подвергаются высокопроизводительной визуализации и количественному анализу локализации эндогенного ферритина и аутофагосомных/лизосомальных маркеров на основе CellProfiler, в данном случае LAMP2. На основании уровня аутофагосомного/лизосомального ферритина можно сделать выводы относительно уровня ферритинофагии. Этот протокол может быть использован для оценки ферритинофагии в первичных фибробластах пациента, полученных от BPAN, или других типах клеток млекопитающих.

Введение

Белки WIPI (WD-повтор, взаимодействующие с фосфоинозитидами) являются эволюционно консервативными эффекторами PI3P с различными ролями в аутофагии1. Четыре человеческих белка WIPI (от WIPI1 до WIPI4) сворачиваются в семилопастные β-пропеллеры с двумя эволюционно консервативными областями, в которых гомологичные и инвариантные аминокислоты группируются на противоположных участках пропеллера. Один сайт выровнен с областью связывания фосфоинозитида в лопастях воздушного винта 5 и лопасти 6. Другой сайт выровнен с областью белок-белкового взаимодействия, где WIPI связываются с различными членами механизма аутофагии или регуляторными факторами аутофагии2.

WIPI4 функционирует в управлении регуляцией аутофагии, вызванной энергией, и на уровне контроля размера растущей зарождающейся аутофагосомы3. Мутация в гене WIPI4, называемом WDR45, является причиной бета-пропеллер-ассоциированной нейродегенерации (BPAN), нейродегенерации с подтипом накопления железа в мозге (NBIA) у пациентов, которая характеризуется гипоинтенсивным ореолом железа в черной субстанции и бледном шаре4. Наличие аномальных отложений железа у пациентов с BPAN провоцирует повреждение нейронов, что приводит к энцефалопатии, общей задержке развития, судорогам и, в конечном итоге, паркинсонизму, деменции испастичности.

Гомеостаз железа жестко регулируется многочисленными клеточными механизмами, при этом концентрация цитозольного железа контролируется уровнями экспрессии и функциональностью переносчиков железа, транспортеров железа и белков храненияжелеза. Концентрация цитозольного железа, в свою очередь, определяет, участвуют ли в этом пути деградации, такие как ферритинофагия7 или протеасомный клиренс окисленного ферритина8 .

Во время ферритинофагии ферритин избирательно рекрутируется в аутофагосомы карго-рецептором NCOA4 и нацелен на лизосомальную деградацию в ответ на низкий внутриклеточныйуровень железа. Учитывая роль WIPI4 в регуляции размера аутофагосомальных мембран3, разумно предположить, что потеря этой специфической функции может повлиять на селективную секвестрацию ферритина в аутофагосомах и, таким образом, на ферритинофагию. Изучение этого ключевого этапа метаболизма железа может открыть двери к терапевтическим возможностям для пациентов с BPAN; Тем не менее, широко используемые протоколы для изучения ферритинофагии в клетках человека только сейчас разрабатываются.

В данной статье описывается высокопроизводительный флуоресцентный метод оценки ферритинофагии в клетках человека. Применение этого анализа к клеткам BPAN, полученным от пациентов, может дать ценную информацию о том, как ферритинофагия отличается от здоровых клеток человека, и может послужить ориентиром для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этого редкого заболевания человека.

Протокол

1. Культивирование и посев первичных клеток

  1. Достаньте флакон с замороженными клетками из резервуара с жидким азотом и держите его на льду до тех пор, пока не дойдете до комнаты для культивирования клеток. В предварительно стерилизованной вытяжке держите флакон в руке, чтобы клеточная суспензия оттаяла. Ресуспендируйте клетки и перенесите их в 10-сантиметровую клеточную культуральную тарелку с 9 мл предварительно подогретого DMEM с 10% фетальной сывороткой теленка (FCS) и 1% пенициллин-стрептомицином (P/S). Осторожно встряхните, чтобы клетки равномерно распределились по тарелке, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5%CO2
  2. На следующее утро посмотрите на ячейки, чтобы убедиться, что они прикреплены. Измените среду на свежую DMEM + 10% FCS + 1% P/S и дайте клеткам расти, пока они не достигнут 80% конфлюенции.
  3. Удалите питательную среду, промойте 2 раза DPBS, добавьте 1 мл трипсина в тарелку и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 10 минут. Добавьте в пластину 9 мл DMEM + 10% FCS, и повторно суспендируйте клетки.
  4. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Определите количество клеток вручную с помощью камеры Нейбауэра и разведите клеточную суспензию в DMEM + 10% FCS до тех пор, пока не будет достигнута концентрация клеток 40 000 клеток/мл.
  5. В 96-луночный планшет со стеклянным дном затравите 100 μл/лунку клеточной суспензии. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 16 часов.

2. Процедуры

  1. Подготовьте следующие обработки в соответствии с Таблицей материалов: контрольная среда, контрольная среда плюс деферазиокс (DFX) для хелатирования железа или контрольная среда плюс цитрат железа и аммония (FAC) для загрузки железа. Готовьте все виды лечения как при наличии, так и при отсутствии лизосомального ингибитора (бафиломицина А1) для оценки потока ферритинофагии.
  2. Извлеките питательную среду из планшета и замените ее соответствующей обработкой (100 мкл/лунка).
  3. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 6 часов.

3. Фиксация и окрашивание

  1. Отсадите лечебную среду и промойте 2 раза DPBS (Таблица материалов).
  2. Добавьте 100 мкл 3,7% параформальдегида (PFA, Таблица материалов) на лунку. Зафиксируйте клетки на 20 минут при комнатной температуре в темноте.
  3. Снимите PFA и промойте ячейки 2 раза с помощью PBS/T (Таблица материалов).
  4. Блокируйте в PBS/T, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 4 °C.
  5. Приготовьте смесь первичных антител (Таблица материалов) в PBS/T (антитело к ферритину 1:50, антитело к LAMP2 1:50).
  6. Промойте клетки 2 раза PBS/T и нанесите 50 мкл смеси антител на лунку. Оберните тарелки парапленкой, и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C.
  7. На следующее утро приготовьте смесь вторичных антител (Таблица материалов) (1:200) в PBS/T.
  8. Промойте клетки 2 раза PBS/T и нанесите 50 мкл вторичной смеси антител на лунку. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 1 ч в темноте.
  9. Приготовьте 5 мкг/мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, Table of Materials) раствор в PBS комнатной температуры.
  10. Промойте ячейки 2 раза PBS/T и добавьте 100 μл/лунку морилки DAPI. Выдерживать 20 минут при комнатной температуре в темноте.
  11. Промойте ячейки 2 раза PBS и добавьте 50 μL PBS в каждую лунку. Оберните тарелки парапленкой и храните при температуре 4 °C в темноте.

4. Автоматизированная визуализация с помощью конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии

  1. Замените PBS в тарелке на 50 μл свежего PBS при комнатной температуре.
  2. Накройте пластину алюминиевой фольгой и отнесите ее в кабинет микроскопии.
  3. Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, установите на стол микроскопа держатель образца для 96-луночных планшетов и выберите подходящий объектив (в данном случае: 40x). Более подробная информация приведена в таблице 1 .
  4. Отрегулируйте параметры изображения (Таблица 1).
    1. В Smart Setup выберите лазеры и фильтры и назначьте их дорожкам (дорожки 1-3) для оптимального качества и скорости изображения (таблица 1).
    2. При выборе типа эксперимента нажмите на кнопку Плитки , чтобы включить возможность выбора и сохранения определенных положений X,Y на пластине.
    3. В модуле Imaging Setup (Настройка обработки изображений ) визуализируйте каналы регистрации, назначенные им дорожки , а также длины волн возбуждения и излучения (таблица 1).
    4. В модуле Режим сбора данных выберите следующие параметры: Скорость сканирования: 6; Направление: двунаправленное; Усреднение: 2x; Бит на пиксель: 8.
    5. В модуле Channels (Каналы ) отрегулируйте мощность лазера, точечное отверстие и коэффициент усиления мастера для каждого канала отдельно (Таблица 2). Настройте эти параметры, чтобы получить правильно экспонированные изображения без их перенасыщения.
    6. Нажмите на модуль «Стратегия фокусировки ».
      1. Выберите «Объединить программный автофокус и определенный фокус».
      2. В разделе «Опорный канал и смещения» выберите наиболее стабильный/самый яркий канал в качестве опорного (обычно DAPI или 488 нм).
      3. В разделе Повторения событий стабилизации и частота выберите Стандартный.
    7. В модуле Программный автофокус выберите следующее: Режим | Интенсивность; Поиск | Умный; Отбор проб | Штраф; Относительная дальность.
    8. Нажмите на модуль «Плитки ».
      1. Выберите Позиции | одиночные позиции.
      2. В разделе «Расширенная настройка» перейдите по пластине, определите положение для визуализации и нажмите кнопку «+ » на вкладке «Настройка позиции ».
      3. Пометьте каждую позицию дополнительной информацией, которая будет записана в метаданных изображения. Для этого откройте вкладку «Свойства », нажмите на значок колесика рядом с выпадающим меню «Категория » и нажмите « Создать », чтобы открыть новое диалоговое окно, в котором необходимо ввести название новой категории . Чтобы присвоить категорию определенной позиции, выберите позицию, перейдите на вкладку «Свойства », перейдите в выпадающее меню «Категории » и выберите соответствующую метку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется создать категорию для каждой обработки, чтобы обозначить каждую позицию с указанием обработки, которой подвергались клетки.
      4. В разделе Sample Carrier выберите Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0. Нажмите « Калибровать», чтобы откалибровать микроскоп по поверхности пластины. Выберите калибровку по 1 или 7 точкам в зависимости от технических характеристик системы.
      5. В разделе Параметры выберите перекрытие плитки в 10%. В разделе Перемещение по мозаичным регионам выберите Гребень. Отметьте галочкой следующее: использовать скорость рабочей области из управления рабочей областью, использовать ускорение рабочей области из управления рабочей областью и пирамиду изображений во время захвата.
  5. Запустите сбор изображений и сохраните результаты изображения (файлы czi) и метаданные изображения (файлы csv) на портативном жестком диске.
  6. Экспортируйте изображения в виде файлов TIFF.

5. Высокопроизводительный анализ изображений

  1. Создайте отдельный файл таблицы метаданных со следующими столбцами: Положение, Скважина, Условие, Серия и Множество. Соответствующие данные для заполнения этих столбцов извлекаются из исходного файла метаданных, полученного в результате конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
  2. Скачайте программное обеспечение с открытым исходным кодом CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Запустите CellProfiler 4.2.4, дважды щелкнув мышью, и импортируйте конвейер CellProfiler (дополнительный файл 1) путем перетаскивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены шаги по составлению конвейера CellProfiler (Дополнительный файл 1) для автоматического распознавания фибробластов с использованием окрашивания DAPI (Модуль 1, распознавание ядер, см. Таблицу 2) и фоновой флуоресценции в одиночных клетках, полученных из AF488 (Модуль 2, распознавание клеток, см. Таблицу 2). Распознавание точек (называемых объектами) определяется размером точек и интенсивностью флуоресценции точек на фоне (Модуль 3, распознавание точек, см. Таблицу 2). Наконец, в соответствии с границами ячеек, знаки отличия, распознанные программным обеспечением, присваиваются соответствующим ячейкам (Assign relationships). Подробное описание того, как реализовать конвейер CellProfiler для исследований аутофагии, было опубликовано ранее9. Кроме того, в таблице 2 приведены настройки CellProfiler, использованные в данном исследовании. Кроме того, в дополнительном файле 2 отображается конвейер CellProfiler (дополнительный файл 1) со снимками экрана, сделанными в последовательном порядке и относящимися к модулям, описанным в таблице 2.
  4. Перед адаптацией конвейера CellProfiler (дополнительный файл 1) перетащите отдельные файлы изображений .czi или папку, содержащую несколько файлов изображений .czi, в модуль «Образ».
  5. Настройте конвейер распознавания изображений. В модуле Имена и типы замените код c1-c3 кодом, который позволяет программному обеспечению идентифицировать и сортировать одноканальные изображения для анализа.
  6. Настройте параметры конвейера для модулей IdentifyPrimaryObjects и IdentifySecondaryObjects , оптимизировав числовые записи в модулях. Значения, использованные в данном исследовании, представлены в таблице 2.
  7. Чтобы отслеживать корректировки, выберите опцию «Тестовый режим », нажав на кнопку «Начать тестовый режим ». Затем нажмите кнопку «Шаг » между модулями. Дождитесь всплывающих окон (исходное входное изображение, контуры распознавания, нарисованные поверх исходного изображения, и результат анализа), показывающие, как будет анализироваться изображение с только что введенными настройками.
  8. Как только конвейер будет оптимизирован, завершите тестовый режим. Выполните анализ, активировав режим Exit Test Mode, а затем нажмите кнопку Analyze Images .
  9. После завершения анализа проверьте точность обнаружения ячеек и точек, сравнив входные изображения с выходными данными наложения (границы ячеек, пункты), созданными CellProfiler. Если результаты неудовлетворительны, отрегулируйте числовые значения в различных модулях (Таблица 2) до тех пор, пока результат анализа не станет достаточно точным.

6. Анализ данных

  1. После запуска анализа подождите, пока программа создаст набор табличных текстовых файлов с результатами. При использовании предоставленного конвейера CellProfiler (дополнительный файл 1) найдите следующие выходные файлы:
    1. Файл CellProfilerOutputCells, в котором перечислены номера изображений, назначенные программным обеспечением, номера ячеек, присвоенные отдельным ячейкам, исходное имя файла и путь, указывающий на место хранения файлов, количество точек (ферритин, LAMP2) на ячейку и средняя площадь точек (ферритин, LAMP2) на ячейку.
    2. Файл CellProfilerOutputExperiment, который предоставляет информацию о технических деталях, связанных с экспериментом (например, версия программного обеспечения, каналы изображений, теги метаданных).
  2. Откройте эти файлы в виде электронных таблиц.
  3. Перейдите к проведению статистического анализа подсчета пунктов и номеров совместной локализации пунктов с использованием предпочитаемого программного обеспечения для статистики (Таблица материалов).

Результаты

Первичные фибробласты, полученные из кожи человека (F-CO-60) от здоровых доноров (рис. 1A), были подготовлены для оценки ферритинофагии с использованием лечения бафломицином A1 с последующим иммуноокрашиванием эндогенного ферритина и LAMP2, автоматизированным анализом изображений и анализом на основе CellProfiler (рис. 1B).

Колокализация эндогенного ферритина и LAMP2 увеличивалась после того, как лизосомальная деградация ферритина была заблокирована добавлением бафиломицина А1, что согласуется с его способностью ингибировать лизосомальные ферменты V-АТФазы и, таким образом, блокировать ферритинофагию7 (рис. 2). Кроме того, в качестве примера приведено программное распознавание клеток, а также распознавание ферритина и LAMP2 (рис. 2).

В связи с этим следует отметить, что описанный здесь конвейер CellProfiler чрезвычайно универсален и может быть адаптирован к дополнительным и/или альтернативным считыванию, таким как оценка влияния определенных мутаций BPAN на рост клеток, митохондрий или других органелл в контексте функциональных систем маркеров одиночных клеток.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор эксперимента. Графическое представление (А) процесса ферритинофагии и (В) экспериментального рабочего процесса для оценки ферритинофагии в первичных фибробластах кожи человека, как описано в настоящем протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения. Первичные фибробласты кожи человека в контрольной среде (условиях кормления) при (А) отсутствии или (В) присутствии бафиломицина А1 подвергали непрямому иммунофлуоресцентному анализу с использованием антител к ферритину и анти-LAMP2, в то время как ядра клеток окрашивали DAPI. Представлены примеры флуоресцентных изображений, полученных с помощью автоматизации конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (масштабные линейки: 10 мкм). Изменения в концентрации ферритина и LAMP2 и колокализации могут наблюдаться при лизосомальном ингибировании при введении бафиломицина А1. Также отображается анализ на основе CellProfiler, показывающий наложения изображений, полученных с помощью программного обеспечения: распознавание клеток (фиолетовый), ядер (синий), ферритина (зеленый), LAMP2 (красный) и колокализующихся точек ферритина/LAMP2 (желтый). (C) Увеличенные срезы изображения (масштабная линейка = 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Настройки конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, использованные в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Числовые настройки CellProfiler, использованные в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Конвейер CellProfiler, использованный в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Отображение конвейера CellProfiler (см. Дополнительный файл 1) со снимками экрана, сделанными в последовательном порядке (см. Таблицу 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Этот метод, в котором используется автоматизированная флуоресцентная микроскопия в сочетании с открытым анализом изображений на основе CellProfiler9 для оценки внутриклеточной локализации ключевых факторов ферритинофагии, был разработан для получения ценной информации об эффективности лизосомального клиренса ферритина посредством селективной аутофагии, называемой ферритинофагией7. Этот протокол позволяет обрабатывать большие наборы образцов с несколькими клеточными линиями и обработками одновременно, а также оценивать желаемые показатели, такие как ферритиновые пунктирные числа и ферритиновые пункты, колокализуясь с LAMP2, который является типичным лизосомальным маркером для оценки потока ферритинофагии. Однако здесь следует подчеркнуть, что точный, автоматизированный анализ изображений зависит от качества изображения, которое, в свою очередь, зависит от специфичности антител и оптимальной визуализации. Поэтому программный анализ изображений должен выполняться только с изображениями высокого качества.

Модуляция уровня железа в клетках может предоставить ценную информацию о механизмах, которые активируются для регуляции гомеостаза железа в контексте заболевания. В данной работе описан метод изучения заболеваний BPAN в клетках пациента, обработанных железонагрузочными и хелатирующими агентами. Деферазиокс (DFX) является известным хелатором железа, широко используемым в полевых условиях10. При нанесении он захватывает свободное железо в цитоплазме и запускает клеточную реакцию на железное голодание. Поскольку целью данного исследования была оценка ферритинофагии, лишение клеток железа было прямым способом стимулирования деградации ферритина посредством аутофагии в качестве компенсационного механизма для пополнения клеточного пула железа. Цитрат железа и аммония (ФАК), наоборот, используется для нагружения элементов железом. Клетки активируют синтез ферритина в ответ на чрезмерные и, следовательно, токсичные концентрации цитозольного железа11. Цитрат железа и аммония, таким образом, способствует синтезу ферритина и удержанию железа в гетерополимерах ферритина, что, в свою очередь, может активировать ферритинофагию.

Для изучения ферритинофагического потока в этом протоколе мы селективно окрашиваем ключевых участников процесса — ферритин и лизосомы (здесь обозначены LAMP2) — и оцениваем их колокализацию. Высокий процент колокализующихся точек указывает на эффективную лизосомальную деградацию ферритина. Чтобы максимизировать информацию, полученную в результате таких экспериментов, можно использовать дополнительные красители или маркерные антитела.

Следует отметить, что этот метод сопряжен с техническими трудностями. Первичные фибробласты, полученные от разных доноров, могут пролиферировать и расти по-разному in vitro. Следовательно, для получения сопоставимых результатов, разные клетки должны быть засажены в одном и том же проходе. Поэтому рекомендуется провести тестовый эксперимент, прежде чем приступать к применению данного протокола, чтобы изучить время удвоения клеток или клеточных линий, которые будут использоваться.

Этот метод не ограничивается изучением ферритинофагии; Просто изменив методы лечения и используемые антитела, его можно перепрофилировать для оценки различных других селективных путей аутофагии; Например, митофагию можно исследовать, используя CCCP в качестве индуктора митохондриального стресса и антитела к оптинеринину, LC3 и LAMP2 для окрашивания12.

В целом, комбинация автоматического получения изображений и анализа с помощью CellProfiler представляет собой мощный инструмент для высокопроизводительной функциональной оценки отдельных фибробластов человека. Это особенно актуально для изучения заболеваний человека, для которых анализ и сравнение больших когорт клеток пациента и здоровых донорских клеток представляют большой интерес.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (проект E03). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>клеточные линии
первичные фибробласты кожи человека Биопсия кожи, здоровый донор человека, Университетская клиника Biobank Tü bingen, Этическое одобрение 389/2019BO2F-CO-60, пассаж 9
<сильный>Обработка клеточных культур<сильный>Конечная концентрация (соединение)
Контрольная средаDMEM 10%FCS(только ДМСО)Контрольная
среда + бафиломицинA1DMEM 10%FCS100 нМ бафиломицин A1
Контрольная среда + деферазиокс (DFX)DMEM 10%FCS30 & микро; M DFX
Контрольная среда + DFX + бафиломицинA1DMEM 10%FCS30 & микро; M DFX, 100 нМ бафиломицин A1
Контрольная среда + цитрат железа и аммония (FAC)DMEM 10%FCS0,05 мг/мл FAC
Контрольная среда + FAC + бафиломицинA1DMEM 10%FCS0,05 мг/мл FAC, 100 нМ бафиломицин A1
Material
Albumin [BSA] Фракция VAppliChemA1391
Alexa 488 козий кроликLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 коза мышьLife TechnologiesA-11003
бафиломицин A1Sigma Aldrich196000
BioLite Клеточная культура обработанная посуда 10 см ThermoScientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS без кальция и магнияGibco14190094
Фетальная бычья сыворотка (FCS)Gibco10437-028
Цитрат железа и аммония (FAC)MerckF5879
Анти-ФЕРРИТИН (селезенка человека)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина)Life Technologies15140-122
Трипсин-ЭДТА (0,05%) с феноловым краснымGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 лунок стеклянное дно #0 пластины CellvisP96-0-N
Solution
3,7% параформальдегид (PFA)растворенный в PBS, pH 7,5 
Бафиломицин А1 100 мМ стокБафиломицин А1 разведенный в
цитрате железа и аммония (ДМСО) 100 мг/мл стокФАК разведенный в автоклавной воде двойной дистиллированной
ПБС/ТПБС, с добавлением 10% твина20 
PBS/T + BSAPBS, с добавлением 10% Tween20, 1% BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel версии 16.50Microsoft Office Plus 365
PFA,

Ссылки

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

CellProfilerLAMP2
Ферритинофагия: оценка селективной деградации железа путем аутофагии в фибробластах человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.