Мы описываем протокол выделения и культивирования эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs). Мы также предлагаем подробные методы получения напряжения сдвига и растяжения для изучения механического напряжения в hSVEC.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция эндотелиальных клеток подкожных вен человека и воздействие контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аортокоронарное шунтирование (АКШ) - это процедура реваскуляризации ишемического миокарда. Подкожная вена по-прежнему используется в качестве канала АКШ, несмотря на сниженную долгосрочную проходимость по сравнению с артериальными каналами. Резкое увеличение гемодинамического напряжения, связанного с артериализацией трансплантата, приводит к повреждению сосудов, особенно эндотелия, что может влиять на низкую проходимость трансплантата подкожной вены (SVG). Здесь мы описываем выделение, характеристику и расширение эндотелиальных клеток подкожных вен человека (hSVEC). Клетки, выделенные с помощью коллагеназного расщепления, демонстрируют типичную морфологию булыжника и экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток CD31 и VE-кадгерин. Чтобы оценить влияние механического напряжения, в этом исследовании были использованы протоколы для исследования двух основных физических стимулов, напряжения сдвига и растяжения, на артериализированных SVG. hSVEC культивируют в проточной камере с параллельной пластиной для создания напряжения сдвига, демонстрируя выравнивание в направлении потока и повышенную экспрессию KLF2, KLF4 и NOS3. hSVEC также можно культивировать в кремниевой мембране, которая позволяет контролировать клеточное растяжение, имитирующее венозное (низкое) и артериальное (высокое) растяжение. F-актиновый паттерн эндотелиальных клеток и секреция оксида азота (NO) модулируются соответственно артериальным растяжением. Таким образом, мы представляем подробный метод выделения hSVEC для изучения влияния гемодинамического механического стресса на фенотип эндотелия.
Введение
Дисфункция эндотелиальных клеток (ЭК) является ключевым фактором в недостаточности трансплантата подкожной вены 1,2,3,4. Устойчивое увеличение напряжения сдвига и циклического растяжения индуцирует провоспалительный фенотип эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs)3,4,5,6. Основные молекулярные пути до сих пор не полностью поняты, и стандартизированные протоколы для исследований in vitro могут....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Неиспользованные сегменты подкожных вен были получены от пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования в Институте сердца (InCor) Медицинской школы Университета Сан-Паулу. Все лица дали информированное согласие на участие в исследовании, которое было рассмотрено и одобрено местным комитетом по этике.
1. Выделение, культивирование и характеристика первичных эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVEC)
- Подготовка
- Автоклав: пара прямых или изогнутых щипцов и тканевые ножницы (7-8 см).
- Приготовьте стерильный желатин. Смешайте 0,1 г (0,1% мас./об.) или 3 г (3% мас./об.) желатин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как правило, прилипшие ЭК могут наблюдаться через 3-4 дня после экстракции. hSVEC первоначально образуют скопления клеток и демонстрируют типичную морфологию «булыжника» (рис. 1B). Они экспрессируют ЕС-маркеры CD31 (рис. 1C, D) и VE-кадгерин (рис. 1D). hSVEC можно легко размножать на обработанной чашке для клеточных культур без покрытия, и они сохраняют эндотелиальный фенотип в культуре до восьми пассажей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сегмент подкожной вены должен быть не менее 2 см для успешной изоляции hSVEC. Небольшие сегменты трудно обрабатывать и связывать концы сосуда для поддержания раствора коллагеназы для изоляции клеток. Уменьшенная площадь поверхности просвета не дает достаточного количества клеток для расширения культуры. Чтобы свести к минимуму риск заражения не-ЭК, манипуляции с сегментом подкожной вены должны быть очень щадящими в течение всей процедуры. Важно соблюдать осторожность при введении наконечников пипеток в просветные поверхн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Благодарности
JEK поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 и 2013/17368-0] и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 и 309179/2013-0). AAM поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% Трипсин-0,02% раствор ЭДТА | Gibco | 25200072 | |
| 15 & слайд I 0,4 Люэра | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-луночная эквидвухосная нагрузочная станция 25 мм | Международная корпорация Flexcell | LS-3000B25. Предметное стекло VJW | |
| 8-луночная камера со съемной лункой | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| уксусной кислотой (ледяной) | Миллипоры | 100063 | |
| Акриловый лист толщиной 1 см | Плексиглас | ||
| Anti-CD31 антитело | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, антитело FITC | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Анти-VE-кадгерин антитело | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex пластины коллаген I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| раствор бычьей сыворотки альбумина | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Хлопковый шов EP 3,5 15 x 45 см | Brasuture | AP524 | |
| Циклофилин форвард праймер | Thermo Fisher Scientific | Custom разработанный | |
| обратный праймер циклофилина | Thermo Fisher Scientific | Специально разработанный | |
| диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 базальная среда | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots добавки | Lonza | CC4176 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 система натяжения | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Флюоромонт водный монтажный материал | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Желатин из свиной кожи | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Глицерин | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Козий антимышь IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Гепарин натрия из слизистой оболочки кишечника свиньи 5000 МЕ/мл | Blau Farmacê utica | SKU 68027 | |
| Насосная система Ibidi (насос + гидравлический блок) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 передний праймер | Thermo Fisher Scientific Индивидуальный | дизайн | |
| KLF2 обратный праймер | Thermo Fisher Scientific | Индивидуальный дизайн | |
| KLF4 прямой праймер | Thermo Fisher Scientific | Индивидуальный дизайн | |
| KLF4 обратный праймер | Thermo Fisher Scientific | Специально разработанный | |
| анализатор оксида азота NOA 280 | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 прямой праймер | Thermo Fisher Scientific | Custom design | |
| NOS3 обратный праймер | Thermo Fisher Scientific | индивидуальному заказу | |
| Sigma-Aldrich | 158127 | ||
| Перфузионный набор 15 см, внутренний диаметр 1,6 мм, красный, 10 мл резервуаров | Ibidi | 10962 | |
| Фаллоидин - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Фаллоидин - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Йодид | калияSigma-Aldrich | 221945 | |
| зеленый набор для ПЦР QuanTitec SYBR | Qiagen | 204143 | |
| платформа QuantStudio 12K flex | Прикладные биосистемы | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Слайдовое стекло (24 мм x 60 мм) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Нитрит натрия | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV система синтеза первой нити | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Трипан синий морилка 0,4% | Gibco | 15250-061 | |
| Коллагеназа II типа из Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Ссылки
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechani....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
