Методическая статья

Совершенствование нумерации спор Bacillus subtilis и анализа меток в проточной цитометрии

DOI:

10.3791/65141

⸱

30 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол фокусируется на использовании проточной цитометрии и счетных шариков для количественного определения бактериальных спор, меченных бромидом этидия. Метод также эффективен для анализа ковалентного сцепления белков на поверхности интактных спор.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Споры Bacillus subtilis уже были предложены для различных биотехнологических и иммунологических применений; Однако возрастает потребность в разработке методологий, улучшающих обнаружение антигенов, иммобилизованных на поверхности спор, и их количественного определения. Анализ на основе проточной цитометрии ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток B. subtilis. В данной работе мы предлагаем использовать проточную цитометрию для оценки эффективности отображения флуоресцентного антитела (ФА) на поверхности споры и количественной оценки количества спор с помощью счетных шариков.

Для этого мы использовали бромид этидия в качестве ДНК-маркера и антитело, меченное аллофикоцианином (APC), которое было связано со спорами, в качестве поверхностного маркера. Количественное определение спор проводили с помощью счетных шариков, так как этот метод демонстрирует высокую точность в обнаружении клеток. Меченые споры были проанализированы с помощью проточного цитометра, который подтвердил связь. В результате было продемонстрировано, что мечение ДНК повышает точность количественной оценки методом проточной цитометрии для обнаружения проросших спор. Было замечено, что бромид этидия не способен маркировать спящие споры; Тем не менее, этот метод обеспечивает более точное определение количества спор с флуоресцентным белком, связанным с их поверхностью, что помогает в развитии исследований, которые сосредоточены на использовании спор в качестве биотехнологической платформы в различных приложениях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus subtilis представляет собой палочковидную грамположительную бактерию, способную производить спокойные споры, когда условия окружающей среды не позволяют клеткам расти1. Споры являются чрезвычайно стабильными клеточными формами, и споры нескольких видов, включая B. subtilis, широко используются в качестве пробиотиков для использования человеком и животными2. Благодаря своей устойчивости и свойствам безопасности споры B. subtilis, которые демонстрируют гетерологичные белки, были предложены в качестве адъюванта слизистой оболочки, системы доставки вакцины и платформы иммобилизации ферментов 3,4.

Для получения спор из B. subtilis необходимо подвергнуть его депривации питательных веществ с помощью специальной питательной среды. После получения и очистки этих спор необходимо количественно оценить их для повышения эффективности теста 5,6. Таким образом, для анализа концентрации полученных спор применяются определенные методы. Можно использовать пластинчатый счет и камеру Петрова-Хауссера, также известную как счетная камера. Последний изначально был разработан для определения концентрации клеток крови; Однако возможно его использование в области микробиологии для подсчета спор 7,8. Несмотря на то, что это стандартный метод, используемый для подсчета клеток, чтение является трудоемким, так как этот метод полностью ручной, и его точность зависит от опыта оператора.

Анализ на основе проточной цитометрии (ФК) ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток Bacillus spp. Использование гранул для подсчета клеток методом проточной цитометрии гарантирует воспроизводимость при подсчете клеток при рутинных исследованиях (абсолютное количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов) и при разработке исследований с участием частиц, которые могут быть обнаружены и подсчитаны с помощью проточной цитометрии9. Годжафри и Альшариф предложили использовать счетные шарики для количественной оценки немеченых спор10. Описано использование проточной цитометрии для мониторинга спороношения у Bacillus spp. путем мечения споровой ДНК 10,11,12,13. В другом исследовании FC использовали FC для оценки количества флуоресцентно меченных белков на поверхности споры15.

Это исследование было направлено на использование коммерческих счетных шариков для обеспечения стандарта воспроизводимости в отношении подсчета событий с помощью проточной цитометрии. В данной работе мы предлагаем использовать счетные шарики для подсчета клеток в ФК для уточнения нумерации спор и оценки эффективности связывания флуоресцентно меченных антител на поверхности спор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Настройка проточной цитометрии

  1. Юстировка оптических параметров проточного цитометра, сопряженного с компьютером
    1. Войдите в программное обеспечение Cytometer.
    2. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Запустите и подождите несколько минут | Режим очистки | Сидячие жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха и препятствия были удалены в процессе инициации цитометра, до взятия образца.
  2. Контроль качества
    1. С помощью реагента контроля качества отрегулируйте напряжение фотоэлектронных умножителей и оцените их чувствительность.
      1. Приготовьте реактив для контроля качества в полистирольной тубе.
      2. Для определения исходного уровня приготовьте гранулы суспензии, добавив 0,5 мл разбавителя (10 мМ отфильтрованного PBS, pH 7) и 3 капли гранул в маркированную пробирку.
      3. Смешайте флакон с бусинами путем плавного переворачивания.
    2. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | CST для подключения к интерфейсу CST. Подождите несколько минут и наблюдайте за сообщением цитометра об отключении.
    3. Присоедините полистирольную трубку, содержащую реагент для контроля качества, к зонду проточного цитометра.
  3. Проверка конфигурации цитометра
    1. В окне "Сводка по системе " убедитесь, что конфигурация цитометра подходит для эксперимента.
    2. Выберите соответствующий идентификатор партии установочных бусин, чтобы убедиться, что выбранный идентификатор партии установочных бусин соответствует текущей партии исследовательских бусин CS&T.
  4. Проверка производительности
    1. Выберите опцию «Проверить производительность » и нажмите «Выполнить».
    2. По завершении проверки производительности отобразятся результаты производительности. Просмотрите отчет о производительности цитометра. Нажмите кнопку «Готово », чтобы завершить проверку производительности, или извлеките пробирку из цитометра и просмотрите результаты в окне «Сводка системы ».
    3. Обратите внимание на окончательный результат анализа морфометрической и флуоресцентной чувствительности, который появится в | сводка системы| результат работы цитометра| со статусом: ПРОЙДЕНО

2. Подготовка спор

  1. После спороношения споры 3 раза промывают сверхчистой ледяной водой центрифугированием при 17 949 × г в течение 10 мин.
  2. Гранулы, полученные в результате последнего центрифугирования, повторно суспендировать 10 мл сверхчистой воды.
  3. Автоклавировать споры в течение 45 мин при 121 ºC для инактивации вегетативных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие тесты, проведенные нашей группой, сравнивающие различные методы инактивации, показали, что условия, упомянутые на этапе 2.3, показали высокую эффективность, не показывая образования колоний в методе анализа гальванического покрытия на среде агара LB.

3. Количественное определение автоклавных спор с помощью проточной цитометрии

  1. Берут 50 мкл автоклавных спор и инкубируют их в защищенном от света бромиде этидия (EtBr, 10 мг/мл, разведенный в воде) при коэффициенте разбавления 0,05% v/v в течение 30 мин (рис. 1A).
  2. Промывают споры 3 раза 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) центрифугированием при 17 949 × g в течение 10 мин и ресуспендируют в 1x PBS.
  3. Добавьте 10 мкл гранул, следуя рекомендациям производителя по разведению.
  4. Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра, как описано в шаге 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подчеркнуть, что гранулы должны быть пипетированы как можно более однородно, так как в расчетах наблюдались несоответствия, когда этот этап не был выполнен должным образом.

4. Анализ с помощью проточной цитометрии

  1. Войдите в программное обеспечение Cytometer.
  2. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Режим очистки | Сидячие жидкости.
  3. Настройтесь на рабочую область, чтобы определить анализ в проточной цитометрии.
    1. Определите вентили для анализа (рис. 2).
      1. Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик частиц на основе отрицательного контроля (немаркированные споры).
    2. Чтобы определить морфометрию клеток, выберите Точечная диаграмма для анализа параметров FSC-A по оси x и SSC-A по оси y.
    3. Чтобы определить флуоресценцию, выберите FL3 Точечные графики по оси y, используя FL5 по оси x, и создайте вентили в четырех квадрантах.
  4. Используйте полистирольную трубку размером 12 x 75 мм с пробкой, содержащую немаркированные образцы, предварительно помеченные одноцветным EtBr, одноцветным APC и многоцветным EtBr+ APC.
  5. Очень осторожно перемешайте пробирку, содержащую отрицательный контроль, и присоедините ее к зонду проточного цитометра.
  6. Нажмите « Приобрести».
  7. Установите мощность лазеров, перейдя в раздел Цитометр | Параметры | FSC (375) и SSC (275).
  8. Установите пороговое значение (500) Цитометр | Порог.
  9. Чтобы удалить автофлуоресценцию, проанализируйте образец без красителей, содержащий только споры.
  10. Отрегулируйте напряжения для детекторов фильтров: FL3 (603) и FL5 (538), чтобы различать отрицательные и положительные популяции по отношению к выбранной флуоресценции в контрольных элементах. Цитометр | Параметры.
  11. Цитометр | Компенсация | Установите смещение настройки FL5/FL3 на 1.0.
  12. После морфометрии и флуоресцентного анализа настройте устройство для получения 30 000 событий | Эксперимент | Макет эксперимента | Приобретение |30 000 событий....
  13. После настройки параметров в проточном цитометре получают данные для образцов, которые маркированы и содержат гранулы.
  14. Рассчитайте концентрацию спор, как описано в инструкциях производителя, используя уравнение (1).
    figure-protocol-1(1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании метод количественного определения валика был сравнен с анализом счетной камеры Петрова-Хауссера. Кроме того, мечение автоклавных спор сравнивалось с мечением неавтоклавных спор.

5. Оценка индекса связывания белков на поверхности споры методом проточной цитометрии

  1. Собирают центрифугированием 50 мкл спор (103/мкл) 17,949 × г в течение 10 мин, а затем ресуспендируют с 25 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК) (300 мМ)).
  2. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте 25 мкл N-гидроксисульфосукцинимида (NHS) (50 мМ) к споровой суспензии и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 30 мин.
  4. Промойте споры 3 раза 1 PBS центрифугированием, как описано в шаге 5.1.
  5. Добавьте флуоресцентный белок и оставьте образцы на ночь при температуре 15 °C.
    Примечание: Флуоресцентный белок, использованный в этой работе, представлял собой меченое APC античеловеческое антитело IL-10. Это антитело было использовано в качестве модели для исследования, хотя применение других флуоресцентных молекул возможно, поскольку EDC/NHS способствуют ковалентному лигированию между группами -COOH и -NH2 , присутствующими в белках на поверхности спор.
  6. Промойте споры в соответствии с шагом 5.3.
  7. Добавьте 10 мг/мл бромида этидия, разбавленного в соотношении 1:50, затем оставьте на 1 ч на льду в защищенном от света месте (рисунок 1B).
  8. Промойте споры в соответствии с шагом 5.3.
  9. Повторите шаг 4.
  10. Чтобы определить флуоресценцию, измените параметры FL3 по оси X и FL5 по оси Y точечной диаграммы.
  11. Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра с синим лазером (488 нм) на FL3 (фильтр 670 LP) и красным лазером (633 нм) на FL5 (фильтр 660/20), как описано в шаге 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Те же образцы были проанализированы на иммунофлуоресценцию на предметных стеклах под микроскопом, при увеличении 1000 x и с использованием следующих фильтров: FITC 480/30 нм (зеленый) и TRITC 540/25 нм (красный).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В образцах автоклавных спор (АС) с помощью счетных шариков и метода Петрова-Хауссера было обнаружено 2 × 103 споры/мкл и 1 ×10 3 споры/мкл соответственно (рис. 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Общая схема количественного определения спор. (A) Споры, помеченные EtBr, и (B)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные методы, такие как пластинчатый подсчет колоний, не только отнимают много времени, но и требуют жизнеспособных клеток и не позволяют количественно определить инактивированные споры5. Камера Петрова-Хауссера является альтернативной методикой, но для ее выполнения требуется опытный микроскопист. Проточная цитометрия зарекомендовала себя как полезная альтернатива для этой цели.

Genovese et al.12 описали использование проточной цитометрии...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Финансовый кодекс 001; Governo do Estado do Amazonas с ресурсами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Авторы благодарят Программу технологического развития в области инструментов для здоровья PDTIS-FIOCRUZ за использование ее возможностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(N-гидроксисукцинимид) (NHS)Sigma130672
Античеловеческое флуоресцентное антителоBioLegend501410APC античеловеческое IL-10
Антимышиное флуоресцентное антителоThermo ScientificA32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  BDПроточный цитометр
BD FACSДива Цитометр Настройка и Набор следящих бусин (использование с программным обеспечением BD FACSDiva v 6.x)BD642412Реактив для контроля качества
BD FACSDiva Программное обеспечение v. 6.1.3Программное обеспечениеBD643629
Центрифуга MegaFuge8R Thermo Scientific75007213
Счетные бусиныBD340334TruCount Tubes
Eclipse 80iNikonFluorescent Microsope
Бромид этидияLudwig Biotec
Фосфат буферный физиологический растворSigma-AldrichA4503
Пластиковые микропробиркиEppendorf
Полистирольная тубаFalcon3520085 мл полистирольная туба, 12 x 75 мм, без крышки, нестерильная

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bacillus subtilis

Похожие статьи